Lezione 12

0:00

S… Speaker 1 (Lezione 12)

serve per verificare che la fluorescenza di strada sia effettivamente una fluorescenza soprattutto a più come non la somma di più a più coni che mai possono essere prodotti ad un risultato di PCR specifico.

0:14

S… Speaker 1 (Lezione 12)

e questa cosa la si fa post corsa perché in un risultato di PCR di Altaic ovviamente quello che noi vediamo è un grafico come questo, diciamo questo è il risultato di PCR e chiaramente questo risultato di PCR ci significa come aumenta la crescenza in funzione del numero di cibi però

0:43

S… Speaker 1 (Lezione 12)

se questa cosa è dovuta a un ampliforio e dovuta a due, da qui non lo potete capire, è solo un segnale di tolicenza che aumenta in un certo modo. Questa è una lezione, ci sentiamo dopo.

0:58

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi se io devo sapere se questa cosa è dovuta ad un suo antitone oppure ad un antitone, chiaramente devo fare il tuo giorno. E quello che si fa è quello che vi voglio vedere l'altro giorno, cioè si aumenta a fine PCR, cioè quando arriviamo qui, si aggiunge un extra step nel quale si aumenta la temperatura in maniera tale da vedere quali sono gli antitoni. Ora, quello che normalmente succede...

1:27

S… Speaker 1 (Lezione 12)

è che si ha una cosa così se uno ha un solo apricone, per cui c'è, questo chiaramente non è più quello di C, questa è temperatura in genere, quindi c'è una temperatura, che è la temperatura di Mertic, di quell'apricone.

1:48

S… Speaker 1 (Lezione 12)

alla quale si ha un drop di fluorescenza perché il double step si apre, quindi la cyber grid si stacca e si dà di fluorescenza. Ora, quello che succede normalmente è che uno qui ha delle gode, cioè la perfezione sarebbe una cosa del genere.

2:05

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Una curva che ci sta liscia, senza altre cose. Infatti chiaramente questo non succede mai perché è un contellato di lavoro. Però quando siamo di fronte a situazioni di questo tipo...

2:29

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Grazie a tutti.

2:47

S… Speaker 1 (Lezione 12)

non attesi o delle interazioni che comunque danno dei segnali di fluorescenza in background che potrebbero far apparire la curva non teorica diverso è il caso in cui uno ha

3:03

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Una cosa del genere, questi sono due picchi, chiaramente, e se sono due picchi vuol dire che ci sono due temperature, una qui e una qui. Se io ho due temperature, chiaramente due temperature nel risultato, è ovvio che qui ci sarà un apricone e qui ci sarà un altro apricone, perché chiaramente la temperatura di melting dipende dalla sequenza dell'apricone.

3:26

S… Speaker 1 (Lezione 12)

E quindi se un ampliore è alta o più alta, perché non abbiamo un contenuto di C maggiore, perché è più lungo rispetto ad un altro, ovviamente io avrò una temperatura di melting X. Se un ampliore è diverso ne avrò un'altra, più basso o più alto sulla parte della sequenza. Quindi in genere, se uno si trova in fronte a un risultato di questo tipo, eventualmente decide di caricarsi il gel, perché comunque questo è sempre un risultato...

3:55

S… Speaker 1 (Lezione 12)

che è un calcolo matematico di una reazione, che è appunto un mezzo di temperatura. Per essere sicuri che poi effettivamente ci sono due altri coni, uno carico un gel, e ci si aspetta di vedere su un gel biolante.

4:09

S… Speaker 1 (Lezione 12)

A quel punto è chiaro che quella PCR non è precisa, che quella PCR deve essere in qualche modo utilizzata. Poi magari l'utilizzazione passa attraverso il cambio della concentrazione della dieta di partenza, passa attraverso la scelta di un'altra temperatura di annini dei primer. Le utilizzazioni ovviamente poi possono seguire strade diverse sulla base anche della vostra conoscenza.

4:33

S… Speaker 1 (Lezione 12)

dell'esperimento che state conducendo, no? Quanto più si hanno informazioni su qualcosa, tanto più chiaramente si può giocare con i parametri. Però ecco, questo è un risultato, chiamiamolo, preoccupante, non quello a cui magari vi ritroverete in laboratorio dove fate un pc per il rialtario e si vedono cose così. Quello non è una cosa generalmente considerata grammatica. Poi anche qui dipende ovviamente da...

5:10

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Ora vorrei parlare di due applicazioni della PCR real-time.

5:19

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Grazie.

5:34

S… Speaker 1 (Lezione 12)

una quantità di espressione, una quantità di DNA più determinante ma l'approccio assoluto relativo ovviamente è profondamente diverso se io faccio una quantificazione assoluta chiaramente voglio per esempio studiare il numero di copie di DNA

6:16

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Grazie.

6:21

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Questa è una quantificazione assoluta, perché non è quanto un paziente è più positivo rispetto a un altro, ma è se il paziente è da considerarsi positiva di nutrizione, quindi c'è un valore soglia stabilito clinicamente, sopra il quale sei considerato affetto, sopra il quale non c'è un'inversione presente. E soprattutto se io stabilisco...

6:48

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Il conto, il calcolo, l'uso di copie possono anche stabilire la gravità dell'infezione, cioè quanto è forte il carico virale, il carico batterico di campione rispetto per esempio a un altro paziente o semplicemente rispetto allo stesso paziente prima di aver subito l'infezione.

7:08

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Per fare questo, chiaramente, quando si fa una quantificazione assoluta, uno bisogna sempre di una retta interattiva. Questa cosa assomiglia molto alla retta che abbiamo visto l'altra volta, che è l'efficienza dei primer, ma sono due cose diverse, diciamo. Questa è una tipica retta interattiva, che significa che io ho fatto delle PCR che sarebbero otti, valdini neri in questo caso, con quantità note di DNA. Immaginiamo...

7:37

S… Speaker 1 (Lezione 12)

sempre di essere un collaboratore che fa un'analisi per stabilire una contaminazione batterica

7:51

S… Speaker 1 (Lezione 12)

e quindi mi faccio delle divisioni seriali di questo DNA che per me è un DNA di riferimento e vedo a quale CT valio esce ogni quantità. A quel punto mi costruisco una letta di taratura fatta come numero di CT sulle Y in funzione del logaritmo della quantità del DNA.

8:13

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi assomiglia concettualmente al discorso fatto per la nascolazione dell'efficienza dei primer, ma in questo caso io l'efficienza dei primer me la sono già studiata, cioè ho visto già che i primer funzionano e che chiaramente questo risultato corrisponde precisamente a questa quantità, questo risultato a questa quantità e via discorrendo.

8:35

S… Speaker 1 (Lezione 12)

A quel punto se io ho campioni incogniti, che faccio correre nella stessa corsa, nella stessa piastra, avrò per i campioni incogniti dei Ct Value, perché ovviamente avrò dei numeri di Ct che escono ai vari cicli di Ct. Per cui poi, dato il Ct, per interpolazione determino il logaritmo della quantità.

9:01

S… Speaker 1 (Lezione 12)

determina la quantità di DNA presente in quello determinato particolare. E ovviamente il basso è una quantità determinata, capisco delle cose, rischio se il campione è che a considerarsi infetto, quanto è infetto e rischio vero. Se rimaniamo nell'esempio di un rapporto alle analisi cliniche e alle analisi ambientali che deve stabilire il livello di una contaminazione.

9:28

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi in questo caso chiaramente questi pallinei sono quantità precise, come è evidente lo stesso discorso che si fa per la retta di natura per la quantificazione delle proteine. Avete parlato sicuramente anche con altre persone.

9:58

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Grazie.

10:00

S… Speaker 1 (Lezione 12)

campione incognito che restituisce una certa assorbanza si stabilisce qual è la quantità di proteine nell'internozionale. Anziché la PSA abbiamo quantità note di DNA, anziché l'assorbanza abbiamo la fluorescenza, ma il discorso è praticamente analogo, che poi è analogo a tutti i concetti di retta migratura che esistono nelle applicazioni di biologia. Diverso è il caso della quantità assorbanza.

10:30

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Perché la quantificazione relativa, che è quella più comunemente utilizzata per fare gli studi di espressione genica, ha come obiettivo, diciamo, finale dell'esperimento quello di restituire quello che si chiama folder change, cioè quanto un target, quindi un genere di interesse, è più espresso in un campione rispetto ad un altro campione che è il campione di controllo.

11:00

S… Speaker 1 (Lezione 12)

ho scelto come campione di controllo. Quindi questo è un tipico esperimento di biologia cellulare. Io ho delle linee cellulari di cultura, decido di testare un farmaco e voglio vedere se l'espressione...

11:20

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi io avrò cellule non trattate, cellule trattate col farmaco e le cellule non trattate saranno il mio controllo e io voglio vedere l'espressione del mio gene rispetto al controllo una volta contato il farmaco alle linee cellulari. Non calcolo quante copie di gene ci sono nei campioni perché quella sarebbe una quantificazione assoluta.

11:42

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Calcolo quanto il gene è espresso di più o di meno in un'unitazione sperimentale rispetto ad una condizione di controllo, che ovviamente è scelta dall'operatore, non è una cosa stabilita da qualcuno in maniera periodistica. Quindi voi disegnando l'esperimento stabilite chi è per voi il controllo e quindi su quella base fate una quantificazione relativa.

12:11

S… Speaker 1 (Lezione 12)

di quanto ha espresso uno o più geni all'interno dei nostri campioni. Faccio un altro rispetto. Qui mettiamo il numero di cicli, sempre da tre centrale, per il discorso che ci siamo fatti. Se io ho questo risultato...

12:43

S… Speaker 1 (Lezione 12)

e questo risultato e questo è il mio campione A e questo è il mio campione B e io immagino che A sia la condizione di controllo per il discorso che ci sono fatto da qui posso dire se il genere di mio interesse è più espresso in B o in A considerando che dobbiamo guardare il cittadino ma questo è il numero che ci interessa questo è il numero che ci interessa qui

13:14

S… Speaker 1 (Lezione 12)

D è più o meno espresso di B rispetto all'A. Perché? Perché ci vogliono più numeri di cibi per arrivare a superare la... Siete tutti d'accordo? Guardando questo risultato, se questo esce a metti cibi e questo esce a fretta, stiamo sempre parlando dello stesso genere, ok? Facciamo tutto che stiamo guardando qui c'è il fatto che è famoso.

13:48

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Immaginiamo che questo potrebbe PCR per P53, solo ovviamente PCR per P53, qui immaginiamo di avere dei triplicati, per cui questo è vero, questo è vero, perché il punto è sempre lo stesso di uscita, anche se variano qui, ma abbiamo detto che il punto ci importa più grande.

14:06

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Se questo esce a 20, esce a 30, 30 dopo 20 vuol dire che qui il gene è meno espresso perché a tempo 0 avrebbe partita la PCR, nel DNA di partenza evidentemente c'era meno più 53 qui rispetto a qui. Questo discorso è sbagliato. Ok? Detta così e solo così è sbagliata. Perché? Perché è vero.

14:33

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Tutto quello che ci siamo detti esce dopo, ce n'è di meno in partenza, perché questo è il significato. Ricordiamoci, noi non facciamo una quantificazione della fine, facciamo una quantificazione dell'inizio, nonostante analizziamo un processo in diretria. Quindi, diciamo, questo primo risultato non può che essere così. Il problema qual è? È che per stabilire se questa cosa è vera, noi dobbiamo essere sicuri che a tempo zero non abbiamo...

15:00

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Adesso noi DNA di meno, perché io potrei avere sbagliato a fare la ripetata, potrei avere sbagliato a preparare il cDNA. Quindi questi due sarebbero uguali se fossero stati messi a tempo zero nelle provette le quantità simili, non dico identiche.

15:24

S… Speaker 1 (Lezione 12)

la perfezione sempre di Dio, diciamo abbastanza simili di DNA tempo zero. Se io imbroglio, per regoletta, per retori chiaramente in questo caso, e all'inizio metto meno DNA del campione B, è chiaro che 53 esce dopo, ne ho messo di meno, non è che ce n'è di meno, ne ho messo di meno.

15:43

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi per la quantificazione relativa, a parte fare questo esperimento, che è l'esperimento giusto, quello più dritto, bisogna fare contemporaneamente un'altra analisi, un'analisi di espressione di un gene che si chiama gene auskipig, cioè di un gene la cui espressione ci si aspetta non cambi, perché a quel punto se il gene auskipig non cambia è ovvio che questa differenza è vera.

16:13

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Mi seguite? Se io so che l'actina è un genere costitutivamente espresso, la trigeralderide 3-fosfato-detrogenasi, genere costitutivamente espresso, la tubulina, genere costitutivamente espresso, faccio la PCR per questi geni e mi escono tutti qui, A e D, vuol dire che se il genere costitutivamente espresso è uguale, questi due sono diversi.

16:43

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Perché se anche il gene costitutivamente espresso è diverso, è chiaro che c'è un problema. Quindi o ho messo meno DNA di P, perché l'ho sbagliata di interpretare, o proprio mi è venuto peggio il DNA. Cioè quando sono andata da RNA a cDNA è successo qualcosa per cui la retrotrascrizione non è venuta benissimo. O addirittura l'estrazione dell'RNA messa a genere non è venuta benissimo. Perché è mai un campione scadente, perché è successo qualcosa.

17:10

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Cosa che non è un dramma assoluto, però lo devo sapere, perché se io lo so, ho due possibilità. Uno, rifaccio tutto, ho capito dopo sbagliato e magari ho sufficiente materiale per rifare la cosa e sto serena. Ho tre possibilità. Due, cambio gene aus keeping, perché magari la tubulina cambia.

17:33

S… Speaker 2 (Lezione 12)

perché in quei campioni la lupolina cambia, e non lo so prima di provarci, e ne uso un altro. Scopro che il gap di H, cioè la grigeraldeide del fosfato di etrogenasi, non cambia, quindi uso un altro gene auskipping. La terza possibilità è che non posso fare niente di tutto ciò, ma ne tengo conto. Cioè nella quantificazione dell'espressione di P su A, tengo conto del fatto che il gene auskipping è pagabile.

18:02

S… Speaker 1 (Lezione 12)

e quindi normalizzo rispetto alla reale espressione del genero Skipping. È chiaro? Sì. Ma ne ho fatto su più di uno. Che tendi più di uno?

18:23

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Allora, A e B sono due campioni diversi e quindi devi fare la reazione del genio skipping sia in A che in B, sì, ma usi lo stesso genio skipping in A e in B. Cioè questi ne sono uno? Sì, però devi fare comunque due reazioni, cioè la reazione la devi fare sia sul campione A che sul campione B e poi puoi scegliere di usare un solo genio skipping.

18:42

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Diciamo che quando uno non conosce bene i campioni, perché magari all'inizio sta mettendo appunto i protocolli, la prima cosa che si fa tra i campioni è provare diversi geni off-kipping, prima ancora di fare il tuo interesse. Così scegli il genio off-kipping meno variabile tra i campioni. Per urmare di fare la PCR su gampie, in cerchina, tutulina, un po' di geni che si sa che si usano come off-kipping.

19:06

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Trovato quello meno variabile, a quel punto scegli quello, così sei sicura che tra i due non dovresti avere variazione, e poi fai il gene target, quello che ti interessa. A quel punto, se i genioschipi mi sono venuti uguali con gli aspetti, visto che li hai provati negli esperimenti precedenti, le differenze che eventualmente vedi nel gene target sono differenze vere. Per fare questo conto, che è un conto appunto di normalizzazione,

19:37

S… Speaker 2 (Lezione 12)

vi devo far vedere questa immagine che tiene conto di quello che succederebbe se uno caricasse il gel di agarosio e cioè se io anziché fare una PCR in realtà che è quello che si faceva prima delle realtà se io anziché fare una PCR in realtà in cui posso seguire questa

20:00

S… Speaker 1 (Lezione 12)

questa cosa. Se io non la posso fare, l'alternativa che ho è fare una piccola normale e dopo un certo numero di cicli cominciare a caricare un gel per vedere quando esce.

20:11

S… Speaker 1 (Lezione 12)

il DNA, cioè quando si comincia a vedere il risultato di amplificazione. Ed è quello che si vede in questa immagine, in questa figura. Questi sono i numeri dei cicli, quindi diciamo uno calica il campione al diciottesimo ciclo, al ventunesimo, al ventiquattresimo, e vede come aumenta il risultato dei target, di interesse, rispetto sempre all'ugene, allo skipping, che è il gap 10, che se vedete...

20:38

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Vengono considerati housekeeping anche perché sono quelli più aggondanti, cioè sono quelli che generescono per primi. È già sospetto se voi avete un housekeeping che esce.

20:48

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Quindi tutto esce dopo il target. Se un geneoskipping esce dopo il target, vi dovete fare la domanda se quello è un buon geneoskipping per il vostro esperimento. In genere i geneoskipping sono costitutivamente espressi, quindi anche più abbondanti, per cui le PCR dei geneoskipping escono sempre in cicli molto precoci rispetto a quelli degli altri.

21:11

S… Speaker 1 (Lezione 12)

e qui è un esempio perché già al digiottesimo ciclo comincia ad avvenire una banda nel gempia carossio che poi aumenta fino di fatto a stabilizzarsi verso la fine della PCR diverso è il ragionamento di tutti questi altri target che come vedete hanno delle uscite variabili ora però in una

21:32

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Se uno vuole fare una quantificazione e non fa una PCR o una semi quantitativa, che fa? Decide di farlo a 39 cicli. Se voi guardate queste bande a 39 cicli, se doveste fare la normalizzazione di ognuno rispetto al GARTH, verosimilmente vi uscirebbero uguali le tipiche di espressione o molto molto simili.

21:56

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Considerate che queste sono analisi d'immagine, quindi uno prende la foto, lo dà a un software che fa analisi d'immagine e manualmente uno ritaglia la bandina e dice quanti pixel ci sono in questa banda, quanti pixel ci sono in questa banda, numero di pixel sul numero di pixel e quello è il risultato.

22:15

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Questo su questo, questo su questo, questo su questo, questo su questo e si ottengono degli histogrammi, dei risultati di espressione. È plausibile immaginare che se facciamo un'analisi d'immagine al 39esimo ciclo le differenze non sono tantissime, non si apprezzano tantissimo. Se ci mettiamo prima al 27esimo, guardate che differenza c'è.

22:39

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Perché qui si capisce che alcuni sono già usciti, altri stanno per uscire, altri non sono assolutamente usciti, il gap di age c'è sempre. Quindi se uno fa un'analisi di immagine ad un ciclo prima, a qualche ciclo prima, ovviamente riesce eventualmente ad apprezzare delle differenze che ci sono nei campioni.

22:57

S… Speaker 1 (Lezione 12)

a tempo zero, perché quel gene è differentemente espresso tra una condizione e l'altra, ma se lo guardo a head point non lo vedo più quella differenza, o la vedo molto sfumata. Per questo la realtà non aiuta in questo, perché siccome non carichi il gel ogni ciclo, ma ogni ciclo che succede la fluorescenza, sai esattamente quando è il momento in cui la fluorescenza si misura.

23:20

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Questo momento è il momento in cui fai la quantificazione, perché dopo potrebbe già essere tardi, dopo si potrebbero cominciare a scomigliare di più. Tu invece vuoi vedere le differenze, e le differenze le vedi a velocità iniziale, esattamente come con la genetica enzimatica. Perché la cut time significa la velocità iniziale? Perché se vai dopo...

23:41

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Potrebbe essere uguale, se si ha velocità massima, la velocità è identica, plausibilmente. Invece a velocità iniziale valuti l'affinità dell'enzima per il substrato. E qui è uguale, è alla velocità iniziale della reazione, se vogliamo fare così, un paragone. Nelle PCR semi-quantitative, come quelle per mettere l'immagine, che ripeto si facevano in un'era pre-Cupisial,

24:11

S… Speaker 1 (Lezione 12)

L'analisi d'immagine si faceva così, o si facevano le divisioni seriali dello stesso campione, o si quantificava la divisione più opportuna, quella che sembrava fare vedere le maggiori differenze, oppure si faceva questa roba di caricare a più cicli diversi il campione, facendo poi le quantificazioni rispetto all'austipi per stabilire qual è la differenza di espressione tra i geni.

24:38

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Poi la PCL del realtime, questa cosa si fa diversamente, in tanto perché chiaramente lo strumento ha un software integrato per fare l'analisi di calcolo, ma poi perché è proprio il calcolo che è diverso. Fino a qui abbiamo parlato di rapporti, quanti pixel ci sono in una banda, su quanti pixel ci sono in un'altra banda, e quello è un rapporto.

25:01

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Nel caso della quantificazione con QPCA si fanno delle differenze, non dei rapporti. E infatti c'è un metodo, che è il metodo del 2 elevato al meno delta delta CT, che è il metodo di quantificazione che usano i software di QPCA per fare le valutazioni.

25:26

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Delta chiaramente significa che ci sono due differenze

25:39

S… Speaker 1 (Lezione 12)

ci viene più facile da seguire come informazione. Per cui ora provo a fare l'elenco delle operazioni, ma vedrete che è una cosa abbastanza semplice. Allora, immaginando il campione A e il campione B, come i campioni di cui stiamo parlando, con A identificato come campione reference, cioè come campione di controllo, io posso stabilire di fare la PCR per preggere i target.

26:09

S… Speaker 1 (Lezione 12)

mio interesse, in cui voglio verificare l'espressione di questi geni in B rispetto ad A, che ripeto è il controllo, più un housekeeping che è l'actina, perché come ci siamo detti devo avere un housekeeping per normalizzare, per normalizzare le eventuali differenze e come dicevo prima la vostra collega potrei avere fatto precedentemente a questo esperimento un altro esperimento in cui ho usato A e B e ho fatto la PCR per diversi housekeeping gene.

26:39

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Ho trovato che l'actina è quello che cambia di meno, quindi nell'esperimento vero e proprio userò l'actina come genosciti. A questo punto, chiaramente qui abbiamo triplicati per ogni lettura perché abbiamo detto che dobbiamo essere sicuri che questo punto è davvero questo punto, quindi due pubblicati, cioè un pubblicato non ci basta, ci siamo triplicati per essere sicuri che almeno due su tre siano identici.

27:07

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi ho i triplicati. Faccio la PCR per l'actina, cosa succede? Che qui, in questo campione, l'actina esce 20,3, 20,2, 20,3 cicli. Quindi diciamo triplicati identici. I tre numeri, tre campioni diversi, escono ad altri cicli, che ovviamente lo strumento segna e saranno i triplicati delle PCR degli altri pregenitari.

27:35

S… Speaker 1 (Lezione 12)

A questo punto, ovviamente, lo strumento fa una media di questi tre, una media di questi tre, una media di questi tre, una media dei tre della pina. Stessa cosa succede nel campione B. Quindi, triplicato alla pina, triplicato ai tre i tre. Media, media, media, media della pina. Il primo delta CT, questo, è quello che...

28:05

S… Speaker 1 (Lezione 12)

si chiama normalizzazione interna, cioè questa media meno questa media, questa media meno questa media, questa media meno questa media, cioè ciascun gene target meno la fine, meno il gene house keeping.

28:23

S… Speaker 1 (Lezione 12)

E quindi qui escono fuori i numeri, che sono appunto le sottrazioni tra la media di questo numero e la media di quest'altro. Quindi queste sono le medie che escono dalla sottrazione, dalla prima differenza tra questi e questi. Chiaramente il stesso discorso succede qui. Questa media meno questa, questa media meno questa, questa media meno questa. E lo strumento si segna i numeri.

28:49

S… Speaker 1 (Lezione 12)

A questo punto per il momento abbiamo soltanto fatto la normalizzazione interna, abbiamo soltanto fatto i pixel di questa banda.

28:58

S… Speaker 1 (Lezione 12)

sui pixel di quest'altra, se vogliamo fare un paragone con la semimente di arriva. Non abbiamo ancora paragonato due campioni, abbiamo soltanto fatto una normalizzazione interna. Il secondo delta CT ovviamente è il delta CT che ci serve per fare il fold of change, cioè per stabilire quanto questo gene, questo gene, questo gene è più o meno espresso in B rispetto ad A. Il nostro esperimento è B.

29:25

S… Speaker 1 (Lezione 12)

il test, ha il contorno, quindi il modo change io lo calcolo di B su A. Per cui faccio il secondo delta CT, che come vedete scritto qua è la differenza tra il delta CT di B e il delta CT di A, per questo si chiama delta delta, perché è la differenza di differenze. Quindi quello che succede è che avrò dei numeri che ovviamente possono essere sia negativi che positivi, dipende

29:55

S… Speaker 2 (Lezione 12)

chiaramente da quale numero più tante che si usano per soltare.

30:00

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Non importa quando dobbiamo prendere il valore assoluto, dobbiamo prendere esattamente il numero relativo che esce, sia che sia più sia che sia meno. Quindi calcolo queste altre differenze. A questo punto, se uno guarda questi risultati e vede o meno davanti, l'istinto...

30:16

S… Speaker 2 (Lezione 12)

è che uno dice, ok, quindi questo è meno espresso in B rispetto ad A, questo è meno espresso in B rispetto ad A, questo è meno espresso in B rispetto ad A, perché c'è un meno davanti. In realtà non è vero, perché questi numeri diventano l'esponente di questa roba qua, che è 2 elevato a meno. Quindi se io metto un meno davanti, chiaramente questo è 2 elevato a più, uguale a meno, meno per meno. Quindi a quel punto il risultato reale è che ho

30:46

S… Speaker 2 (Lezione 12)

un numero positivo, risolvendo ovviamente rispetto all'esponenziale 2 elevato a meno delta delta ct, avrò quanto in più in questo caso è espresso del genere di interesse del campione B rispetto al campione A. È chiaro? Perché 2? Cos'è 2? E quindi cosa rappresenta? Cos'è che abbiamo detto l'altra volta? L'efficienza della reazione. Quando è 2,

31:29

S… Speaker 2 (Lezione 12)

2-1% fa 100%, quindi noi stiamo assumendo con questa formula che l'efficienza della PCR che stiamo usando è del 100%, per cui se non lo è...

31:42

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Abbiamo un conto sbagliato, perché questa è pura matematica, cioè i numeri che escono vengono manipolati con un'equazione matematica, 2 elevato meno qualcosa. Se quel meno qualcosa viene da una reazione di PCR che non è efficiente al 100%, stiamo facendo un errore, perché noi stiamo usando un esponenziale, in questo caso un esponente, che non risponde alla sua base, perché questa cosa funziona solo se la PCR è...

32:11

S… Speaker 2 (Lezione 12)

al 100% efficiente, se la PCR non è 2 ma è 1,9 o non considero il risultato o qui devo mettere 1,9 perché altrimenti non è la quantificazione perché se cambiate la base i numeri vengono completamente diversi e un conto è dire che un genere è 10 volte più espresso e un conto è dire che è 5 volte più espresso

32:33

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Non è una differenza irrilevante. Quindi chiaramente quando si usano questi approcci, perché considerate che muove tutto questo discorso, ma chiaramente quando uno fa la PCR il risultato è quello dello strumento, non è che tu a manina ti metti a fare i conti, delta GT, delta GT, la media, si può fare, perché uno può tirarsi da i grezzi dalla macchina, ma è chiaro che non si fa, se non ce la fa la macchina, è chiaro che non fa lo strumento.

33:00

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Però lo strumento parte da un astuto che è un astuto vostro, la PCR funziona al 100%, se non funziona al 100% lo sapete solo voi, lo strumento non lo sa, perché è settato per calcolarla come 100%, a meno che qualcuno non gli dica, vedi che a sé che 2 devi mettere 1,8%. A quel punto esce poi un altro calcolo, ma se non lo sapete potreste tirare fuori dei dati di quantificazione completamente sbagliati, proprio perché...

33:28

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Non è un gene in cui uno delle bande che escono, sono dei numeri che alla fine finiscono in histogrammi, per cui voi avete un'immagine come questa nel vostro risultato. Questo gene è molto meno espresso in queste tre condizioni rispetto a questa. Chiaramente nella parte finale del conto, il campione di controllo viene posto a uno.

33:54

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Quindi il campione di controllo sarà il vostro 1, in questo caso A sarà il vostro 1 e B sarà quante volte in più o in meno rispetto ad A è espresso. Quindi avrete un grafico così se è non espresso o un grafico così se è espresso. Ma il vostro controllo sarà 1 come numero, diciamo così, nel risultato finale. È chiaro? Domande?

34:26

S… Speaker 1 (Lezione 12)

se poi ve ne vengono ne discutiamo

34:28

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Considerate che questo è effettivamente il metodo più allo stato attuale largamente utilizzato per fare i profili di espressione genica perché nelle macchine PCR real-time si possono avere le piastre da 92 pozzetti o da oltre 100 o anche oltre 300 quindi si possono analizzare contemporaneamente molti campioni con relativamente poco tempo perché in fondo questa è una reazione di PCR.

34:58

S… Speaker 1 (Lezione 12)

può durare due ore

35:00

S… Speaker 1 (Lezione 12)

quando va tutto lungo, però uno mai può attestare 10 target differenti o molti campioni differenti, tutti nello stesso esperimento. E' chiaro che la cosa migliore è che se uno deve fare una cuglioranza giusta, è che se uno deve confrontare il controllo con tanti altri campioni...

35:20

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Tutto deve correre nella stessa piastra. Cioè non si fa una piastra di controllo e poi si fa la piastra con i campioni. Per cui sono due esperimenti diversi. Poi dovete avere tutto nello stesso esperimento. Controllo e test. E eventualmente se non vi entri nella piastra fate più piastre in cui il controllo viene sempre caricato. Perché altrimenti come fate a portificare? È il controllo interno. Non si può non avere il controllo all'interno della piastra.

35:48

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Negli ultimi anni, come vi avevo già detto, questa tecnica con la Cyber Green si sta facendo soppiantare dall'utilizzo della TACMAN, che fino ad ora è stata sempre usata soprattutto per gli studi di Sniper, per i morfismi in generale, adesso con la stessa filosofia si usa la TACMAN per fare l'espressione genica.

36:14

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Chiaramente in quel caso c'è molto meno lavoro di ottimizzazione sulla coppia di primer o su le terapie mule che riscoprendo perché la TACMAN si basa su una sonda gene specifica e quindi viene disegnata caso per l'operatore.

36:32

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Per cui in genere il processo di ottimizzazione è molto meno dispendioso in termini di tempo rispetto a quello che non succede con la Cyber Ring. Però è ancora molto usata la Cyber Ring perché è estremamente versatile, voi potete fare tanti campioni tutti con la stessa piastra perché la Master Mix della Cyber Ring è una sola, cioè la sonda è sempre la stessa.

36:53

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Vi faccio vedere la TACMAN, anche se è una cosa che vi avete detto che avete già visto, quindi la vediamo giusto rapidamente per ripetizione un po'. La TACMAN si basa sulla TREP, che noi abbiamo già visto, se vi ricordate, come filosofia, cioè sulla possibilità che due molecole possano...

37:17

S… Speaker 1 (Lezione 12)

se sono vicine in questo caso, quenchare il segnale luna dell'anica. Noi l'abbiamo vista composto dell'immunofluorescenza in cui l'eccitazione del primo fluorocromo dava segnali sul secondo fluorocromo se erano abbastanza vicini. Qui invece è un fenomeno differente perché la seconda molecola è un quencher che se è molto vicino al fluorocromo assorbe la fluorescenza e quindi non ve la fa vedere.

37:44

S… Speaker 1 (Lezione 12)

però il principio biofisico dietro è sempre lo stesso. Quindi quello che succede normalmente nella Tuckman è che, a parte la coppia di primer che ci deve essere per il gene, perché stiamo sempre parlando di una PCR, quindi c'è sempre la purificazione del DNA e quindi ci deve sempre essere oltre al primo arca libero, per cominciare l'extension, abbiamo una sonda. La sonda, ripeto, è gene specifico.

38:10

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi il DNA, il primer si annilano e si annila anche la sonda. A questo punto, prima di andare avanti, nel disegno di questa cosa, a cosa devo stare attenta sicuramente? Mi viene in mente che bisogna tenere sotto controllo in questa situazione, guardando questa criade, perché non è una coppia. Posso calcolare la temperatura dei primers?

38:50

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Devo considerare che anche la sonda entra nel gioco, è una cosa a tre, quindi io devo sapere, devo trovare una temperatura che vada bene per fare la dilinte primer e anche la dilinte della sonda, altrimenti non funziona l'esperimento. Quindi diciamo, parte l'extension è se la sonda si è abbaiata regolarmente sullo strand di DNA, nel momento in cui arriva il...

39:18

S… Speaker 1 (Lezione 12)

che si sta producendo a causa della normale reazione di PCR, la sonda viene spiazzata, viene staccata dall'interazione con il single strand e mentre viene staccata viene anche rotta, per cui il cromoreporter, che è molto vicino al querger in questo disegno, perché sono due molecole vicine, si troverà libero. Una volta che si trova libero, lontano dal querger, chiaramente il querger non riesce più.

39:45

S… Speaker 1 (Lezione 12)

a coincere la fluorescenza, quindi ad assorbire la fluorescenza, e la fluorescenza viene emessa. E questo dà un'informazione sulla base dell'esperimento che si sta facendo. Questo è soltanto il principio di funzionamento generale.

40:01

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Nel caso dell'applicazione che avete già visto, cioè della genotipizzazione degli SNIP, quello che succede è che si riesce a fare genotipizzazione degli SNIP perché le sonde possono variare anche per il simbolo nucleotide e quindi l'appaiamento della sonda wall type o della sonda mismatch non è perfetto. Nel momento in cui l'appaiamento non è perfetto,

40:29

S… Speaker 1 (Lezione 12)

l'estensione del DNA a causa della PCR che va avanti può o non può rompere la sonda perché se questo è il nostro stand equal type che porta una G e quindi questa è la versione equal type dello snit chiaramente nella sonda io metterò una C se nel mio campione c'è la G quindi sto facendo un'analisi su una popolazione e c'è la versione in G la sonda si attaccherà

40:59

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi quando arriva l'extension, il reporter si libera, emette fluorescenza e io so che in quel camione c'era una certa quantità di popolazione con lo slip nella forma guardata.

41:10

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Se invece c'è la versione mutata, per cui per esempio io ho costruito una sonda a G, questa sonda mi si attacca perché appunto nella mia popolazione c'è soltanto G, quindi questa sonda mi si attaccherà. Per cui quando arriva il DNA, il DNA non rompe la sonda perché la sonda non è attaccata e quindi io da questo segnale non ho fluorescenza e quindi posso determinare che nella popolazione che sto analizzando c'è soltanto la versione wattage dello G.

41:40

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Oppure no, ovviamente, perché questa è la possibilità più scema se vogliamo, è anche quella che non si realizza mai, cioè è chiaro che se uno fa un solo di popolazione e se lo aspetta una certa variabilità di SNIP, a meno che proprio non si tratta di una cosa di popolazione specifica e quindi quel gruppo di persone è tutto con lo stesso SNIP. Però generalmente ci si aspetta che ci sia una certa variabilità se quella posizione nel genoma è uno SNIP.

42:08

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Quindi magari io avrò una certa quota di fluorescenza associata alla forma dual type, una certa quota, una certa percentuale di fluorescenza associata a quella mutata. E quindi io saprò nella popolazione qual è la percentuale di versione dual type o di versione mutata dello split. Perché questo? Perché i due segnali di fluorescenza sono in due colori diversi. Ovviamente questo deve essere presupposto se no.

42:34

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Non si capisce niente. I due reporter usati per le sonde, una metterà nel verde e l'altra metterà nel rosso. Se io ho queste due cose posso quantificare quanto verde c'è, quanto rosso c'è e quindi quant'è la percentuale di versione voltaico, di versione mutata dello SNI all'interno della popolazione che si analizza. È chiaro? Sì, no, forse. Domande?

43:04

S… Speaker 2 (Lezione 12)

Come fa la sonda ad attaccarsi solo fino a base di un solo nucleotide? Allora, è una domanda pertinente che mi sono sempre fatta pure io ma non l'ho mai fatta più di genetica, allora non bisogna chiedere. Però le usano così, perché evidentemente sono molto piccole le sonde.

43:20

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Cioè, diciamo così, la spiegazione che mi sono data io è che sono molto piccole le solde, cioè sono più piccole di un primer e quindi basta un solo nucleotide per non fare bene il match. Perché se pensiamo alla sign-elected mutagenesis in cui un sigolo nucleotide comunque consente l'appaiamento del primer, questa non dovrebbe funzionare.

43:40

S… Speaker 1 (Lezione 12)

a teoria, diciamo, perché o per una cosa o per un'altra. Quindi quello che mi sono data io di spiegazione, perché non è una tecnica che faccio io e quindi non so per le cose belle e pratiche, è che forse la sonda ha una sequenza molto, è una sequenza più alta e quindi se su 5 o 2 di 1 non è giusto, chiaramente è più facile che non sia pari, su 20 1 conta meno. E non è specifico? Eh? Non è specifico in questo modo.

44:10

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Cioè non si può coinvolgere il tempo qua. E questo deve avere la semplicità che è legata allo SNIP, ovviamente. Cioè se quella è una sequenza di quello SNIP unico, cioè gli SNIP del genoma sono siti unici, si parte da quel presupposto lì. Cioè in teoria lo SNIP è un sito univoco, o abbastanza univoco all'interno del genoma, motivo per tuttare durante gli esperimenti, scusatemi, durante i...

44:38

S… Speaker 1 (Lezione 12)

giusto il sequenziamento del genoma umano, hanno usato gli SNIP per ricostruire la sequenza, cioè se io facendo il sequenziamento avevo nel mio verso sequenziato uno SNIP, quello SNIP normalmente era sicuramente associato a quel posto nel cromosoma, nel braccio lungo corto, in quella posizione lì, perché quella è una posizione unica del genoma.

45:02

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Sempre, vuol dire, mi viene come risposta basandomi sulle teorie che conosco. Dopodiché, ammesso che la sonda si leghi altrove, se si lega solo la sonda è non un problema, perché l'esperimento funziona con la coppia di primer della sonda. Se si lega la sonda a una parte e il primer no.

45:26

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Non dovrebbe succedere niente, perché è l'amplificazione che fa o non fa proprio nella somma. Quindi, siccome quando la somma è integra non c'è fluorescenza, ammesso che si levia altrove, non te ne accorgi, diciamo così. Te ne accorgi solo se la corte di primer funziona.

45:45

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Un'altra cosa del mismatch è credo anche sia la temperatura, cioè probabilmente tutti questi esperimenti si fanno con delle temperature molto stringenti per essere sicuri che si appaia soltanto se si deve appaia. Quindi magari basta una T e una G che ovviamente non sono, non contribuiscono alla temperatura.

46:21

S… Speaker 2 (Lezione 12)

quindi penso che sia tutto molto bilanciato su questi parametri

46:26

S… Speaker 1 (Lezione 12)

Non giuro, perché ripeto non l'ho mai fatta, però credo che sia bilanciata su questo. E adesso con la stessa logica fanno l'espressione genica perché chiaramente se uno disegna una sonda gene specifica, fortemente gene specifica, e lo fa anche per la housekeeping gene,

46:45

S… Speaker 1 (Lezione 12)

si riesce a fare questa operazione senza dover farsi l'ultimo conto del 2 elevato almeno delta del TCT, che ha tutte queste implicazioni legate all'efficienza al 100% della PCR e via discorrendo. Quindi sta cominciando a prendere piede anche nel senso del liquo dove deve fare tante analisi di espressione. Se devi fare solo 2 geni, usi ancora questo sistema perché riesce a farti tutte le...

47:11

S… Speaker 1 (Lezione 12)

le ottimizzazioni con calma, se devi fare 100 geni potrebbe venirti meno costoso costruire una serie di sonde specifiche e fare l'analisi così. Quindi ho fatto anche di praticità economica qua alla fine. Altre perplessità che sono in grado di rispondere? Ok, e allora ci fermiamo qui e ci lasciamo anche qui, scusatevi ma devo andare a costare.

Ko te whakarāpopoto

E pātai ana ki te AI Mo tēnei whakahuatuhi