PEM PHCA 5 - Parte Teórica

0:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Hi ha una muchacha, però m'ha parlat i diu que ha perdut algú. Però... Vendrà a l'8 i a l'1. I després... A vosaltres amb alguns ja hem fet algun seminari.

0:33

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Ja són les iòlogues, Serrana Muñoz, i el seu ordre d'unís de virus patològica, que l'avantferes del mòdul s'ha presentat. Llavors, el que us explicaré avui és una miqueta com segueix el circuit i la mostra de virus molecular, farem un exercici curtet i farem una visita en la vostra història. D'acord? Doncs ara que ja porteu més temps en natura, ja ho veiem, la genètica, la pell de guà.

1:08

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

que són un cervell, que de la majoria són patòlegs, que són adhesions. De vegades estan entrant les estèmiques de biologia molecular, les estèmiques de la genètica. Per què? Penseu que entra més la genètica i per què serveix. I m'heu de parlar fora, que soc sorda. Us ho recordo. Què paper es poden tenir? Volem dir el que vulguem. No sigueu tímids. Bé, i que baixarà la predisposició a certes malalties, no? Mutacions i aquestes coses. Detectar mutacions, para?

1:51

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

O sigui, per predir, hi ha molta gent que s'associen amb el risc de patir una malaltia. Que s'associen més amb patir una malaltia? Sí. Bé, tal com tu estàs dient, que vas per l'hereditari, però a nosaltres el que ens arriba és normalment una mostra de tumor. O sigui, la malaltia ja la tenim. No estem en un escenari que anem a predir risc. En tot cas, si tenim una lesió i ens trobem una mutació...

2:23

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

que pogués estar associada a tenir un risc més alt de patir un tumor, que seria el pitú de malalties hereditàries de les que estaríem parlant bàsicament, què haurien de fer? El patòleg bàsicament és diagnosticar, però està diagnosticant, pel que sigui demana un estudi genètic, i en trobo una malaltia, per exemple, l'altre dia que tenien un meduló a l'estòma, ens van trobar.

2:54

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

un carcinoma medular de tiroides, ens vam trobar una mutació que està associada al MEN2, que és un síndrome de predisposició a tenir càncer de tiroides, feocromocitoma, etc. Llavors, si jo trobo aquesta mutació, què he de fer? Que jo sé que està descrita associada a un risc de patir aquests tipus de tumors i a més me l'estic trobant en un tipus tumoral que està dintre d'aquest espectre de tumors. Què faríeu?

3:26

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Comprovar o descartar que la resta de tumors associats no hi són. Controlar o descartar? Aquesta persona té risc hereditari. Llavors, davant d'una persona que té risc hereditari de tenir tumors, el tumor que té l'has de tractar. Aquest l'has de tractar. I aquest ja el tenim. Vull dir que el càncer de tiroides que tinc en aquest moment l'has de tractar. Alguna cosa més que haguem de fer a nivell de precaució possible a síndrome hereditari? Estudio genético.

4:01

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

La majoria de mutacions les pugui tenir a nivell somàtic només, que seria un tumor esporàdic, però hi ha algunes que se sap que també estan associades a predisposició. Per exemple, si trobes una persona jove amb un càncer medular de tiroides o que ha tingut altre tipus de càncer i et trobes a més aquesta mutació, si sabem que hi ha un risc genètic, el primer és descartar que sigui a nivell genètic o només del tumor. Per què? Perquè si és a nivell genètic probablement aquesta persona farà més tumors.

4:31

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Si està a nivell somàtic té aquell tumor i et tractaràs, no cal que s'amoïni més, però potser si té a nivell germinal, que està tot a les seves cèl·lules i per tant és quan tindrà realment una predisposició més alta, l'haurem de derivar a consell genètic. La feina nostra ja ha acabat. Nosaltres hem diagnosticat aquesta mutació, però consell genètic serà qui farà l'estudi a nivell germinal i...

5:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

de confirmar que a nivell germinal realment tingui la mutació, què hem de fer amb una persona que té més predisposició? Controlar-la. Controlar-la. Molt més. Per què? Per què farà?

5:11

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

amb molta més possibilitat de tumors, llavors tu ja saps que té aquesta mutació a nivell germinal, igual si per aquest tipus de tumor amb un tractament determinat ja es pot considerar curat una persona normal o té un seguiment que potser és d'un any o cada dos anys o el que sigui, en una persona que tingui predisposició hauràs de fer un control estrictat tota la seva vida.

5:34

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Ja són derivats. Entra dintre allà de la nostra feina fer aquest control? No. Però si jo faig un estudi i m'ho trobo, i quadra, el primer és informar consell genètic perquè citi el pacient, o jo o l'oncòleg, que sigui, depèn del circuit que sigui. I a part, si tinc una persona que té una mutació associada a càncer hereditari, l'implica només amb ella? No. O sigui, té fills de alguna manera d'edat...

6:07

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Si té germans, si té familiars que puguin estar afectes, doncs si la persona fa el consentiment i està d'acord, s'agrada de fer un estudi d'extensió. Si jo tinc una mutació que me la detecten a nivell germinal, el metge pot citar directament els meus fills per fer un estudi d'extensió, els meus germans.

6:49

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

no és igual a tots els països, d'acord? Aquí necessitem un consentiment informat. És una pregunta de curiosa, que si passa molt això que trobis una mutació i derivis aconsellament i... A veure, mutacions. Primer, el càncer terminal és al voltant del 10%, no acostuma.

7:17

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Fins fa relativament poc, nosaltres anàvem a mirar, sobretot, mutacions que estaven en oncogens. Els oncogens, excepte aquest cas del MEN2, que és l'oncogen RET, hi ha pocs oncogens que estiguin associats a risc hereditari. Per què? Perquè si tens una mutació de partida en un oncogen, això acostuma a ser incompatible amb la vida, si la tens a totes les teves cèl·lules. En tot hi ha excepcions, la biologia és la ciència de les excepcions.

7:45

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Què passa ara? Ara estem fent panells de seqüenciació, panells que estàs mirant molts llens. Llavors, de vegades, en el tumor, ens trobem mutacions que podrien ser, que podrien ser que estiguessin associades. La majoria de les vegades no seran germinals. Però si tu la trobes en el tumor i és una mutació que està descrita també a nivell germinal, doncs pot passar. Llavors, aquí què fem? Tenim un comitè de tumors.

8:15

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

que el fem en setmanal, on revisem els resultats que hem tingut i si en algun tumor, clar, la mutació en un suprès no tumoral, me la puc trobar, per exemple, P53, que és el que està més mutat. Està associat a... també el trobes amb síndrome de l'ifraumeni. P53 és el que està mutat en tots els tipus de tumor. Cada dia, de les mostres que passem, més de la mitjà que la mutació P53. Ara.

8:43

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Totes les mutacions de P33 que nosaltres trobem no són associades a risc germinal, no estan descrites a nivell germinal, probablement perquè totes no són igual d'agressives o igual de greus. O perquè hi ha algunes, al revés, que són tan greus que no són compatibles amb la vida, pel que sigui, però no totes estan descrites a nivell germinal. I després, en un lefragomeni t'esperes tenir tumors en gent molt jove. Sí.

9:11

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Nosaltres passem els casos i trobem gent que és més jove de 30 anys, que té tumors, que ja és més freqüent, encara que el càncer està creixent en població jove, com en càncer colorectal. Trobes una que és germinal, que podria ser germinal i és una persona jove, llavors en el comitè es diu, ei, tenim aquest pacient que a nivell somàtic hem trobat aquesta mutació.

9:37

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

probablement de ser el germinal, però llavors el Consell Genètic és qui s'encarrega de consultar amb els experts de genètica germinal si aquella votació en concret està associada, mira la història del pacient i ja és qui decideix si fa la citació o no. Llavors ens anem trobant, sí, que acabin derivades del Consell Genètic realment.

10:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

poques, però cada vegada més, perquè és com tot, si et fan un tag sencer et troben cosetes, que potser no són cosetes patogèniques, però que potser en el moment que les troben sí que diuen, bueno, anem a mirar-ho. Va passant. El que deien a nivell ètic, aquí per llei no podem, necessitem un consentiment informat del pacient perquè digui que es pot comunicar aquest resultat a les familiars.

10:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

És veritat que la majoria dels pacients diuen que sí, però si el pacient digués no vull que se sàpiga ni que no sé què, no se li pot dir a ningú. En altres països, jo crec que a França això ho estan replantejant, perquè si jo sé que tu tens una mutació germinal i que tens un fill, és ètic no fer un seguiment al fill quan li podries fer un fill o un germà, el que sigui, quan li podries fer una detecció perquè vols de fet tumor.

10:57

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Hi ha països, jo crec que als Estats Units no és obligatori, a Xina, a Corea se lo salten tot, vull dir, això és heterogènic, però és una cosa que va evolucionant i hi ha comitès ètics i de moment nosaltres estem en un país que és molt garantista. Si tu no vols fer, no vols saber, doncs dir jo no vull fer, jo no vull saber i no vull que es digui un tercer.

11:25

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Ajust-la per genètica, però ja hem dit que és la menys freqüent, genètica germinal. Ara, en quant a la genètica d'aquell tumor en concret, per què serveix fer un estudi genètic? Hi ha mutacions, o sigui, per exemple, com la mutació del genmic, o que, no?, vull dir, translocacions, que et poden servir per identificar quin tipus de càncer és. Molt bé, per diagnosticar, no? Hi ha algunes alteracions que són característiques d'un tipus de tumor concret.

11:56

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

La majoria d'alteracions poden estar en diferents tipus de tumor, però si el patòleg té una hematoxilina que té una pinta determinada, una microscopia electrònica, la biologia molecular veus una pressa més del puzzle. De vegades ajuda a diagnosticar. Veurem alguns exemples. Hi ha vegades que ja tenim el diagnòstic. Això ja està diagnosticat. Al patòleg ja no faig més feina. Per qui li pot interessar més si tenim alguna alteració concreta? El tractament també.

12:27

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Perfectament. Llavors, el nostre client, entre cometes, deixa de ser el patòleg, el patòleg ja no necessita la meva feina per diagnosticar, ho he dut diagnosticar, però l'oncòleg necessita saber com està algun biomarcador, perquè o bé és una diana terapèutica, tens algun fàrmac que si tens aquella alteració funciona i si no, no, o bé és un marcador de resistència a fàrmacs, o bé li dona un pronòstic més bo, més dolent a la malaltia.

12:58

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Llavors, en aquests tres escenaris el nostre client en recometes deixa de ser el patòleg i passa a ser l'oncòleg o el clínic que està tractant el patòleg. I cada vegada hi ha més biomarcadors que estan associats a tractaments o resistències o a obtenir un millor o un pitjor pronòstic. Per tant, bàsicament són aquestes tres potes. Diagnòstic, tractament, diagnòstic, pronòstic,

13:28

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

tractament i aquest altre derivat de la identificació de les alteracions que és germinal i que hi ha un poció en el que és el seguiment ja no d'aquest humà en concret sinó d'ara. Material de partida. Podem treure DNA, podem agafar una mostra de l'aire i cada cop les tècniques són més precises i podem treure DNA d'aquí i després mirar a veure què ha passat per aquí i trobaran el nostre DNA que anem expirant. Ara, dintre del servei.

14:04

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

La font principal i més normal que heu vist de material biològic, quina és? Les biòpsies. I les biòpsies, normalment, com les tenim? El primer en formol, després es fa la mostra com parafina... Exacte, la majoria de les vegades hi ha algunes tècniques que requereixen deixit congelat, però la majoria de les vegades passem per formol. Això és la nostra mostra estrella, és la més abundant. Sí que és veritat que tenim també...

14:38

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

altres tipus de mostres, tensiós citològiques, de tant en tant ens arriben sangs, líquids pleurals, però la majoria de les vegades passem pel bloc de parafina, que d'avantatges té moltes, perquè entre altres coses porta molt temps entre nosaltres, el teixit fixat en formol manté l'arquitectura, per tant permet que vegi el patòleg l'arquitectura del teixit.

15:00

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Podem fer moltes tècniques diferents, el podem guardar a la temperatura ambient. Sí que és veritat que si fa molta calor i o s'anirà degradant amb més rapidesa, no és etern, però ho podem guardar molts anys. Imagineu-vos que tinguessin la mostra congelada, quants congeladors necessitaríem per guardar la mostra? Si hi ha el nostre arxiu d'anatòmia patològica, l'hem de tenir en part externalitzat perquè no ens hi caben aquí els blocs.

15:24

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

És un material que a nivell retrospectiu jo puc fer estudis perquè em puc rescatar i mirar a veure què passa. Però, tot té peros. Per la biologia molecular jo crec que és de les pitjors coses que podem tenir. Per què? El fórmula el que fa és fer, mantenir l'arquitectura del teixit, fer ponts entre el DNA i DNA, DNA i proteïna, proteïna, proteïna, i fa com si fos una vestida, com si fes una xarxa. Una xarxa molt tupida.

15:54

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Aquella xarxa, quan volem fer, per exemple, una immunostoquímica, nosaltres hem de fer un desenmascarament higienic. L'hem de perforar, l'hem de trencar una miqueta perquè pugui entrar i reconèixer l'actitud. Si jo vull fer estudis d'àcids nucleics, de DNA en concret, que és en el nucli, jo he de trencar aquesta xarxa per poder accedir als àcids nucleics. Però quan es trenca, quan jo intento trencar aquests ponts o desfer-los, el que fa...

16:24

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

és que també s'entrenca en deu material. El DNA és una molècula que és molt llarga, si a la cromosa me l'estirem és una molècula molt llarga, sempre es fragmenta una miqueta durant les extraccions i fins i tot per treballar amb ell necessitem que estigui una mica fragmentat, però el que ve de formol té mala qualitat, tant a nivell de DNA com a nivell, quan volem treballar. Llavors això és un hàndicap. Els nostres companys de bioquímica que treballen amb fluids corporals,

16:56

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

fan unes PCRs que poden amplificar quilobases i nosaltres, si tenim sort, amplifiquem 300 parells de bases. Què vol dir això? Que si jo vull anar a estudiar un gen gran, l'he d'estudiar per trossets, perquè parteixen un material molt fragment. I això fa que hem d'adaptar les nostres tècniques. A vegades hi ha tècniques de detecció de patògens.

17:20

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

que tenen posades en una microbiologia, però que les sospites en un bloc de parafina, nosaltres els fem l'extracció, perquè són uns protocols que són diferents, que en teixit fresc, perquè necessites matxar més el teixit per trencar aquests fons del formol, i quan els enviem a microbiologia diuen que no han pogut fer res, perquè no han amplificat. Per què? Perquè els tenen dissenys que estan dissenyats per fragments grans. Llavors aquí hem d'adaptar les tècniques.

17:50

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

És un hàndicap, no acostuma a ser horrorós. Normalment nosaltres podem fer determinacions moleculars. Ara, no totes les mostres són iguals. Després de fer l'extracció haurem de fer un control de qualitat per veure si està més o menys degradada perquè segons si s'ha fixat més temps o menys el grau de degradació varia i de tant en tant en trobem una mostra que no és amplificable perquè està sobrefixada.

18:15

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Llavors, estem en el lloc on es fan tècniques més fines, però si la part de dalt és la de la fixació. I és això, si està tan, tan, tan sobrefixat que té un nombre de ponts que és impossible de trencar, de vegades no sou capaç de determinar. Què veurem avui? Veurem una mica el circuit de les tècniques que estan basades, la majoria d'elles, en PCR i que estan basades en extracció de sis nucleics. Veurem una miqueta què és el circuit i farem una pràctica de seqüenciació.

18:55

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I després hi ha tota una sèrie de tècniques que estan basades en hibridació in situ. En hibridació in situ vol dir que tu tens el teixit o tens una extensió de cromosomes o tens les cèl·lules en una extensió citològica i sobre aquell sostrat, que allà sí que tu veus les cèl·lules i pots veure quines són tumorals i quines no, farem una hibridació amb unes ondes i depèn del que jo vegi interpretaré el que ha passat. D'acord? A grosso modo.

19:21

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Aquestes en les que jo faig extracció de DNA, i segueixo dient que sempre hi ha excepcions, però bueno, això ja ens ho trobarem. Però, grosso modo, quan jo faig extracció de DNA o RNA, la gran majoria, la immensa majoria de les tècniques estan passades en la reacció encadenada a la polimerasa, que vosaltres ja segur que l'heu vist i l'heu patit, i estan dirigides a veure coses que són relativament petites.

19:47

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

SN1 és que serien single nucleotide variants, canvi d'un únic nucleòtic o d'un grupet de nucleòtits, insercions i delesions que són relativament petites, com el tenim molt fermentat, les coses que jo puc veure...

20:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

són de mida petita. D'acord? I, en canvi, les tècniques que estan passades en hibridació en situ, les acostumo a utilitzar per veure coses que impliquen una mida gran d'ADNA. Per exemple, reordenaments cromosòmics, traslocacions o inversions, perquè tu ja tens un tros que pot ser...

20:24

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

de diverses quilobases o de megabases. Si hem dit que ho tenim a 300 parells de base, és molt esmicolat. Aquí serà més difícil veure aquests ordenaments. Amplificacions gèniques de lesions de grans zones d'un home. Avantatge d'aquestes tècniques? Aquestes tècniques jo directament vaig a identificar la cèl·lula tumoral. Aquí jo tinc una secció, hi grido i veig què passa. Aquí jo tinc una barreja de cèl·lules tumorals o no tumorals. I estret.

20:57

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

de tota l'hora. I el que jo veuré són tècniques que s'anomenen de balk, de balk, a granel. Jo trec el que hi ha a la mostra i a partir d'això, d'acord? Això ja ho hem vist, que abans, fa uns anys, però jo ja cada cop és més vell, teníem prou, per exemple, en catalogar entre si tinc a nivell histològic un adenocarcinoma o un carcinoma escamós quan en trobo en un càrcer que promo de cel·lular no petita.

21:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Però ara no tenim prou amb això perquè dintre dels adenocarsinomes sobretot s'ha vist que hi ha alguns que tenen mutació de Carras, altres que tenen mutació de GFR, hi ha diferents fusions, normalment aquestes són les cruets entre elles, o mutacions de Viraf, etc. O sigui que tenim encara una proporció gran que no sabem què li passa, que és desconeguda, que no sabem quines característiques té, perquè normalment anem a...

21:58

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

estudiar alguns concrets, però comencen a aparèixer una altra capa d'informació, que és la biologia molecular del tumor. Cada vegada passa més. En aquest cas del pulmó és perfectament, però, per exemple, en el cas del sistema nervió central, ara es parla molt de diagnòstic i la histologia del tumor, però cada vegada més es necessita integrar amb dades moleculars per acabar de suprir part. Per què? Perquè cada tumor és diferent.

22:31

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Tu pots arribar a fer el tumor, tocar més o menys les mateixes vies, però diferents sectors de cada dia. I al final fas la cèl·lula prolifèria. I a més en el càncer de pulmó, en l'adenocarcinoma, què passa? Que tenim teràpies dirigides. LFR-MUTAT, fucions de LK, ROS, RET, ENTRAP, tenen teràpia dirigida. Algunes mutacions de Carras tenen teràpia dirigida. És a dir, que li fa faltar més informació en un cone.

23:01

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

En aquest cas què estem? Per exemple, càncer de pulmó. Com penseu que són generalment les mostres de mida? Ens donen per fer tot el que vulguem o acostumen a ser mostres petites, tenint en compte la ubicació de tots els tipus tumorals, tenint la mateixa disposició de teixit? No és el mateix si tens un glioma, que no t'ho poden treure tota la bèstia perquè tindràs una sèrie d'efectes.

23:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

molt bèsties secundaris, no és el mateix arriba un pulmó que de vegades costa molt arribar a la lesió i vam punxant, vam fent fibroscòpies i no hi ha manera de tenir una mostra que sigui prou representativa que si tenim per exemple una mostra tumoral que sigui més accessible com un càncer colorectal, com un melanoma que el tenim més exposat, vull dir que hi ha vegades que anem limitats i el pulmó és una d'elles. Llavors anem limitats, necessitem més biomarcadors.

23:58

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Això ha fet que ens moguem d'una perspectiva que mai marxarà, perquè ens segueix fent falta en alguns casos que normalment han de mirar un gel determinant cada vegada i un fragment determinant cada vegada, a cada vegada més i amb més tumors que m'entren dintre del que seria indicacions de sequenciació massiva. És a dir, jo he de veure moltes alteracions genètiques, tinc un deixit limitat,

24:26

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I si poden tenir implicacions o diagnòstiques o pronòstiques del tractament, és més eficient tant a nivell preu com a nivell temps global, com a nivell viabilitat, perquè si vaig de gent en gent fent aplicacions una en una, una en una, una en una, em quedarà al final sense teixit i sense mostra, fer una tècnica d'NGES que d'una tacada ens dona informació de molts marcadors. Fa falta sempre.

24:56

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Jo només he de saber què passa amb la gent quit.

25:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

O si només he de saber si tinc la mutació de Virraf, em faig una determinació de Virraf, serà més ràpida, més barata, i aquí ja he acabat el meu estudi. Però cada vegada més entra l'ENGIES i l'ENGIES ja està dintre de la pràctica clínica habitual. En l'examen algú deia que encara era d'investigació. És d'investigació el millor quan fas un estudi de tot l'exoma o de tot el genoma.

25:27

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Però a nivell del dia a dia el que fem són parells de gens que dic, a veure, si jo sé que aquests 50 gens poden estar infectats amb càncer, estudio d'una taca d'aquests 50 gens. O segons quin tumor sigui, estudios en 60, i si ja vaig molt perdut, potser estudios 500. Normalment ens quedem amb parells de gens que són més rellevats. Podeu preguntar-ho, eh? Doncs aneu-hi a veure quin és el circuit. El primer pas que necessitem és...

26:01

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

o la patòloga, faci una selecció dintre de la mostra d'on tinc el tumor. Perquè hem dit que estrellem normalment els ismocleics a l'oestia i llavors no m'interessa que el meu tumor pugui dividir tant així normal. I a més a més necessito que em digui, que m'estimi, que jo crec que és una feina molt difícil, quin és el percentatge de cèl·lules tumorals respecte a les cèl·lules que no són tumorals.

26:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Això és una feina que és difícil perquè jo puc tenir, penseu, patòleg, per què estic entrenat? Per anar a veure la cèl·lula dolenta. És el que m'interessa. Si tinc 20 bones i una dolenta, jo aquí tinc la dolenta. I a més a més, de vegades les cèl·lules tumorals també tenen el nucli que és més gran, són cèl·lules més grans, són cèl·lules més atípiques. Si jo tinc una cèl·lula tumoral i tinc 20 linfòcits,

27:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

L'àrea que m'ocupa això, quasi és la mateixa que m'ocupen els dents linfòsics. Però jo tinc una en 20. I això per què m'interessa saber? Perquè els dents que nosaltres estudiem els tenim a totes les nostres cèl·lules. Una cèl·lula normal, imagineu-vos que jo vull buscar si hi ha una mutació en un oncogen. Mutacions en oncogens, normalment que les tinguin homozygosi o heterocigosi.

27:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

normalment en heterocigosi. L'oncogen és com l'accelerador del cotxe. Ara que tinc un test activat, ell me diu, venga, la prolifera. Què passa? Imagineu-vos, un a un, una normal, una tumoral, realment, de còpies mutades, aquí tinc una de cada quatre. Tinc una mutada i tres normals. I jo vull detectar aquesta. No és el mateix? Com totes les tècniques, normalment hi ha una competència dels reactius.

28:02

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Pels alers, si jo amplifico carras, estic amplificant els quatre carrasos. No és el mateix si tinc aquest escenari, que més o menys estic en 50% de còpies mutades i 50% de còpies igualtades, això que tinc, una, dos, tres, quatre mutades i 50 igualtades. Què necessitaré en un escenari així? Tenim que és que siguin més sensibles. Llavors,

28:35

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Normalment, i el que va millor en els laboratoris d'anatòmia patològica és tenir múltiples tècniques per cada opció i segons com sigui la mostra utilitzaré una o una altra. Cada tècnica té pros i contres. Hi ha algunes que són més sensibles però potser veus menys coses. Però si jo tinc una mostra que no em dona...

28:59

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

per veure-ho tot, perquè és una mostra molt limitada, que tinc molt poca representació tumoral, i tinc una tècnica molt sensible per veure quatre cosetes, com a mínim mino aquelles quatre cosetes, i mira, si alguna de les quatre està tocada, bingo, ja ho tinc. Però necessito sempre saber quina és la representació tumoral. I és una tasca que és difícil, i que una dels reptes que tenim és d'harmonitzar, perquè hi ha variabilitat entre persones.

29:28

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Hi ha variabilitat dintre d'una mateixa persona. Tu veus una mostra que té quatre cèl·lules i dius quina porqueria, i si la següent té sis, dius, home, està molt bé. I potser també el percentatge. És una tasca que és difícil. I aquí la intel·ligència artificial segur que ens ajudarà a ser més objectius. D'acord? Una vegada tinc jo la cèl·lula, la mostra seleccionada, el tècnic de laboratori què farà?

29:57

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Doncs, si tot és tu...

30:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

El tumor pot tallar directament rollitos de parafina en un tub Eppendorf. El nostre objectiu és d'anar-nos al tub per estraure els asis nuclens. Si tinc una zona tumoral determinada, el que farà serà fer una sèrie de talls i rascar directament, macro-disseccionar aquesta zona que és la que m'interessa. I això ho passarem a un tub Eppendorf. Què fem en aquest tub? Afegir-ho a la proteassa, un enzim que degradi el teixit.

30:28

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Això ho deixarem digerit, que pot ser des d'hores a tota una nit. Hi ha diversos protocols que impliquen tota una nit. I després de fer una sèrie de passos, el que farem serà purificar. Aquí tindrem una amalgama de restes de proteïnes, glucis, etc. I el que m'interessa és purificar els acis nucleics i separar-los de tota la resta. Com separem els acis nucleics? Normalment, quina carnet té?

30:57

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Una signocleic negativa, positiva? Negativa. Negativa. Té l'esquelet del DNA i de l'RNA, que té aquells grups fosfat, té suprafosfat, la ribosa o la desoxirribosa del fosfat. El fosfat li dona càrrega negativa neta. Això ho utilitzem quan volem fer una electroforessi, que segur que a pràctiques heu fet electroforessis, oi? Per separar mides. Sí. Però també per purificar.

31:22

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

per purificar el que tenim, són o ve unes membranes, veieu, això és una columneta que aquí té una membrana, o hi ha altres sistemes que van amb boles magnètiques, que estan recobertes de càrregues negatives, llavors posarem en contacte amb la membrana o amb les boles el llissat celular, l'ADN o l'RN tindrà càrregues negatives, i aquí el que poso és un buffer,

31:53

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Tampoc, que el que fa és de pont perquè té unes càrregues positives. Un cop s'uneix els acis nucleics i tot allò altre que pugui tenir càrregues negatives a la cèl·lula en aquesta membrana o en aquelles esferes, farem una sèrie de rentats per anar envoltant-nos tot el que no ens interessi i quan jo consideri que allò ja està prou net...

32:21

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

uns protocols establerts que diu fes 4 rentats amb això, 5 rentes amb un altre, passarem un altre buffer en el qual eliminarem les càrregues positives, això pot ser amb aigua o amb el que sigui, i llavors

32:39

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

O centrifugarem i llavors aquí en un tub net recollirem els desis nucleics perquè se separaran de la meva membrana i llavors baixaran. O en el cas d'aquí, de les boles magnètiques, en el líquid del pouet em quedarà lliure el pàfer de lució amb el meu pací. A partir d'aquí, totes les mostres tindran la mateixa quantitat de DNA o d'RNA. Quatre cèl·lules, tota la resta necrosi...

33:16

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

ho haurem de quantificar perquè les tècniques necessiten una determinada quantitat de DNA i RNA i a més no totes tindran la mateixa qualitat pel qual moltes vegades farem un control de qualitat per veure si és un DNA que està molt molt molt molt fragmentat o si puc amplificar fragments més grans perquè també com que tenim diverses tècniques a part de la sensibilitat el que ens interessa és si jo tinc una tècnica que de fer una PCR que m'amplifica 300

33:45

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

i tinc un altre que m'amplifica 80, i veig que el meu DNA només et puc amplificar fins a 100, m'he d'anar a la de 80, la de 300 entre 3 coses. Això per tenir el DNA. Ara, com dissenyem els estudis? Cogemos el kit i lo hacemos? Sí, pode ser, però ens interessa saber què és el que hem d'estudiar. Per exemple, aquí teniu el Genkit.

34:17

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

és un gengui codificat per una proteïna de membrana, que és un receptor amb activitat tirosinquinasa. Veieu? La part de dalt és una representació dels aminoácids de la proteïna, tenen 976 aminoácids, tenint un domini tirosinquinasa que està dintre de la cèl·lula.

34:39

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Aquestes les proteïnes amb activitat receptores, amb activitat tirocinquines intracel·lular, us cansareu de veure-les. Avui veurem diverses, perquè moltes vegades, com activen vies de senyalització que acaben la proliferació cel·lular, estan alterades en càncer. En el cas del genquí, tenim aquest domini tirocinquines a nivell intracel·lular.

35:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Tenim un domini de regulació que està just per sota de la membrana i tenim uns dominis estaccel·lulars que són d'unió lligant. Normalment funciona quan hi ha lligant, això dimeritza. Quan dimeritza hi ha una fosforilació creuada a nivell dels dominis tirosinquinasa i això fa senyalització. Això és una pàgina que es diu EncoCabell, que podeu provar, té molta informació, però és una pàgina americana i fa com una setmana.

35:30

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

que si la vols fer servir a nivell assistencial és de pagament. Nosaltres no estem, haurem de demanar una llicència. Normalment a les pràctiques fins avui, fins a aquest grup, ens ficaven a la pàgina, però quan et fiques dos brares i et diu ja no tens ni un res més fins que paguis. Amb la qual cosa avui anirem a nivell de diapositives. Però, si és per recerca es pot utilitzar...

35:50

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

El que passa és que també restregen si estàs en un centre, si ho fas des d'un centre, en un hospital, i llavors a la que fa servir et diuen, eh, que l'estàs fent, l'utilitzes fraudulentament, ja no pots fer-la servir més, però vosaltres a casa potser sí que podeu utilitzar-la si us subscriviu gratuïtament i dieu que està a recerca. Podem provar. Llavors aquesta pàgina és molt útil perquè tu li poses el nom del gen i llavors tens aquest gràfic que et diu on s'han descrit mutacions.

36:20

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Pots mirar si és un incogent o si és una supressió tumoral, et dona informació, vas obrir fent estretes i et dona informació. En el cas de QIT és un incogent i també et diu quins tipus de tumors tenen més freqüència de mutacions a QIT. Imagineu-vos que jo estic davant d'un tumor estromal-gastrointestinal i em demanen un estudi de QIT. Veient això, que és on tinc les mutacions descrites, val la pena que jo m'estudiï què passa amb tot el GenQIT.

36:50

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Cal que l'estudiï tot o puc anar-me a regions concretes. A les regions concretes. Sí. On ens aniríem? On hi hem d'esplicar les mutacions. La resta, aquí no hi haurà mutacions i si trobo alguna no sabria quin significat té. Per tant, això ens ajuda a dissenyar quines zones he d'amplificar i d'estudiar. Els oncogens, quan viure el patró de mutacions, sempre és un patró de punts calents, de hot spots. Per què? Penseu que un oncogen...

37:30

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Un oncogen, per ser patogènic, ha d'estar constitutivament activat. Funciona malament perquè funciona sempre, però ha de funcionar. Jo no puc muntar d'on demé de la gana? No, si toco un lloc crític que alteri el seu funcionament, allò no funcionarà. Jo puc tenir aquí una mutació que et trunqui la proteïna, que et doni un estoc prematur. Això de cara al càncer no té cap paper.

38:05

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Tindrà un paper millor en altres malalties perquè aquí també és important per fer altres coses. Però encara el càncer, si jo tinc una mutació aquí que sigui una mutació inactivadora, tot el que sigui mutacions inactivadores no tindrà paper. I les mutacions que jo trobi han de ser mutacions que facin que la proteïna sigui més activa. Pel mecanisme que sigui, però més activa. Per tant, no puc fer qualsevol cosa, sinó que toco llocs molt crítics.

38:34

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Per exemple, troco el domini pirosinquinasa, mutacions que fa que aquest domini, independentment que això estigui dimeritzat, assenyalitzi, fosforili a les proteïnes que estan per sota, o troco aquesta regió que està aquí, que és una regió que normalment fa que si no hi ha unió al lligant, això no faci dimers, sinó que estigui separat a la membrana i per tant no assenyalitzi. Regions reguladores, regions activadores. No ho puc fer tot.

39:06

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Per això sempre que mireu no volíem veure aquests punts calents. En canvi, un supersalto moral, que jo el que faig és espatllar-lo, maneres d'espatllar les coses, tinc mils primaturs en diferents llocs, punts crítics de la proteïna, amb la qual cosa, si vosaltres entreu a un COG-B i busqueu, per exemple, P53, veureu que teniu mutacions per tot. Per què? Perquè fer les coses que funcionin més, tinc poques. Doncs aniré allà, a dissenyar els primers.

39:44

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Després, això és la mateixa visió del Genki, però aquí tens els exons. Veieu? El domini tirostomquinasa, el domini justa membrana, que és aquest exo 11. I aquí tenim diferents... Aquí tenim aquest tumor estromal gastrointestinal.

40:00

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I els colors indiquen on s'han detectat les mutacions. No és el mateix. Els cromos hematològics, que veiem que la majoria de mutacions les té a l'exo 17, no? En el cas del GIST, quins exons estudiaríeu? Bé, l'1 al 8 no m'interessen pràcticament mai, no? El GIST, que el tinc de color blau, a quins exons vaig? A l'11.

40:30

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

El 9, l'11, 13 i el 17 ja poquet. La majoria de les vegades tenim les mutacions, la mida de la bola indica si és més freqüent o menys, entre el 9 i l'11. Nosaltres quan no ho fem per engiès, el que fem és una aproximació, que primer mirem a veure què passa amb el 9 i l'11, perquè l'11 està mutat en el 81% d'escalda. I si allà ja no veig mutació, ens dic, bueno, vaig a provar a veure què passa amb el 13 i el 17. Però la resta no m'interessa res.

41:00

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Ara, jo tinc un melanoma maligna. El nou, cal que l'estudi, tinc un tumor hematològic. El nou, que és dels més freqüents, també el segon més freqüent en G, no. Llavors, cada tipus és el mateix actor, és qui, l'estic mutant, però no es muta de la mateixa manera en tots els tipus tumorals. Llavors, depèn de l'aplicació, no és el mateix que em demani l'estudi un dermatòleg per estudiar un melanoma, que em demani un patòleg per veure que passem un G.

41:31

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

un oncòleg per veure les hemogies. I això em serveix per dissenyar els meus primers. Jo vull amplificar i seqüència això, dissenyaré primers que magnifiquen el 9, el 11, el 13 i el 17. I depèn de l'aplicació que tingui, estudiaré un o estudiaré els altres o els estudiaré tots. Ja hem estret el DNA, anem a fer la PCR. Què necessitem per fer una PCR? Què fiquem al tubet? Nucleotids. Nucleotids.

42:07

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Podem fer còpies del DNA, per tant necessitem d'NTPs, d'oxinucleòtits, clar, la T, la C i la G. Què més? Un bàfer. Parlem ara, la veritat, porto audífons, però els audífons a les persones sordes no recuperen tot el món mai. Llavors ho passo malament i us ho faig de petit, però llavors no sigueu tímits i em podeu cuidar. Un bàfer, sí, tots els enzims...

42:41

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Necessiten uns cofactors, un màfer que portarà magnesi, etc. Què més? L'ADN polimerasa. Què més? Un primer. Els primers o sebadors? Un o dos. Per fragment, si jo vull amplificar, vull veure què passa aquí, haurem de dissenyar un primer forward i un primer reverse, que acotaran el fragment que jo vull amplificar. I què més?

43:23

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Jo fico tot això en un tub i se m'amplificarà alguna cosa? Parla mal, sisplau. Sí, la màquina que fa els cicles de calor. La màquina sí, però no li trobeu res més a faltar. Fico un nucleòtic, una DNA polimènesa amb cebados i un buffer en un tub. Demostra. Si no hi fico DNA no amplificarem res. Si puc ficar DNA, puc posar RNA.

44:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

directament per fer una amplificació amb una DNA polimerasa. Hi ha vegades que jo de partida he d'estudiar l'RNA. Si jo el que tinc de partida és l'RNA, què necessito fer abans de fer una amplificació amb DNA polimerasa? Retrotranscribir. Sí, ho he de passar a DNA. Faré una retrotranscripció amb un encim que és la retrotranscriptasa. Això ho passaré a DNA còpia.

44:34

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I aquí ja ho puc posar a fer la PCR perquè això és una DNA polimerasa. Llavors sí que hi ha aplicacions que necessito partir d'RNA però llavors ha de fer una retrotranscripció. I amb tot això faré la reacció de PCR. Important perquè després ens...

45:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

servirà per a la pràctica de seqüenciació. Al DNA, les dues cadenes complementàries tenen polaritat. Sempre hi ha un extrem on ens queda un grup 5' fosfat i un extrem on ens queda un grup 3' OH. Això no me'n recordo molt bé, però si això tenim la ribosa o l'exorribosa, aquí tenim el grup fosfat. Això són els carbonis.

45:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Llavors, això ve de la numeració del carboni, llavors, si és un, dos, tres, quatre i cinc, el fosfat sempre està enganxat a aquest carboni. La base nitrogenada, no me'n recordo per on està, no sé si és aquesta posició, i en aquest grup sempre hi ha un OH. Llavors, el següent nucleòtic es fa un enllaç entre el grup fosfat, el següent nucleòtic, i aquest grup OH.

45:56

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Llavors queda aquí un oxigen entremig. Llavors, perquè creixi la cadena, sempre creix en aquesta direcció. Sempre es polimeritza aquí i es va allargant a partir d'aquest 3' OH i sempre necessitem aquest grup OH, viure. I això, que ho necessitem i que és així, ens servirà per fer la seqüència, si jo veureu com. Llavors...

46:21

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Tinc els dos cebadors, primer s'uniran a la seqüència complementària perquè la polimerasa sense una petita regió de doble cadena és tonta i no és capaç de començar a copiar. I si tinc aquest grup 3' o H lliure, i aquí tinc una T, per exemple, em posarà una A, si tinc una C, una G, etc. Ja anirà creixent.

46:41

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I això ho anem repetint moltes vegades. Primer, el primer pas és desnaturalitzar. Si tinc doble cadena, he de separar la doble cadena perquè puguin entrar als cebadors. Els cebadors s'uniran a les seves seqüències complementàries a una temperatura una miqueta més baixa, que és la hibridació. La desnaturalització normalment és calfor 95 o 94. I després torno a modificar la temperatura perquè sigui l'òptima delocació de la polimerasa. I la polimerasa?

47:11

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

anirà a copiar fins que jo torni a pujar la temperatura. De manera que si això és el template i això és la zona que jo vull amplificar, el primer cicle d'amplificació, aquí se m'anirà aquest primer primer i anirà a copiar fins que jo torni a canviar la temperatura, tot el que n'hi doni temps, normalment són cicles.

47:34

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Aquest igual. I en el segon cicle què passa? Tenim les cadenes mares, que són aquestes negres, que passarà exactament el mateix, còpies fins on li dóna temps, però quan parteixo d'una d'aquestes cadenes que ja s'han copiat en el primer cicle i entra el primer complementari, el primer complementari ja hem dit aquí. Per tant, comença a copiar i aquí, on se li acaba la cadena a copiar, s'acaba el fragment. I així em queda apuntat.

48:05

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Amb la qual cosa, com això és exponencial, al final el que tindré és milions de còpies de fragment que a mi m'interès. D'acord? I algunes còpies de fragments que són una mica més llargs, però que aniran molt diluïts. Tècniques de PCR tenim de molts tipus moltes adaptacions i aniran que en surtin més cada vegada. Diferencies. Puc treballar amb cebadors que no estiguin marcats en fluorescència o amb cebadors que sí que estiguin marcats en fluorescència.

48:38

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Dintre dels no marcats, hi ha vegades que només amplifico en un únic fragment, seria una PCR simple, tinc una única parella de cebadors, i potser tinc prou saber si tinc banda o no. Per exemple, jo tinc una mostra que vull detectar si hi ha el virus del papinoma. Si vull saber si hi ha o no, amplifico.

49:04

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Tinc un control positiu i tinc sempre un control negatiu perquè la PCR és molt potent i el principal problema són les contaminacions i més quan amplifico sempre el mateix. Si veig banda positiu, si no veig banda negativa, que jo puc utilitzar vàries parelles de cebadors alhora. Per exemple, és el que sigui una PCR multiplex. Per exemple, nosaltres utilitzem per fer aquest connexialitat fèntic del DNA, per veure en una mostra fins a quan podem amplificar.

49:39

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I tenim parelles que m'amplifiquen 100, 200, 300, 400 pares de base i 600. Jo després faig una electroforesi, començo els de primers, doncs aquestes dos mostres estan prou bé. Aquesta amplifico 300 i aquesta s'insinua fins i tot. Perfecte.

50:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

les meves tècniques ja funcionen. Millor que això, rana vegada tinc. Se va a dos mercats. Se va a dos mercats el que... Quan parlem de l'hidroforessia negarosa, que és la que vosaltres heu fet, o en el... Ja és aquí la mida, que són les que haureu fet a les pràctiques alguna vegada. Fixeu-vos, això són 300 i això són 400.

50:22

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Si jo en el meu producte vull diferenciar si tinc 300 o 310, no ho veuré, veuré més o menys les bandes que migren igual. Si necessito més resolució, perquè jo vull diferenciar si el fragment que està amplificat té 200 o 202 parells de bases, o 201 parells de bases, no pot fer una l'efforescè negarosa, perquè no és prou resolutiva.

50:49

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Què faig en aquests casos? Utilitzo un analitzador de fragments, que en lloc de fer un gel relativament curt, el que tenen és, el que fan és un electroforessi capilar. Jo poso aquí la mostra, tinc unes agulles que la punxen i tinc un capilar que és molt llarg i que té un polímer. Com que és molt llarg, la separació de fragments és molt més...

51:23

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

fina. Després, com això no podria visualitzar el gel de garosa, el fiques en una màquina de fer fotos i fas una foto. Tenyeixo el DNA amb el que sigui i fas la foto. Aquí el que faig directament és marcar en fluorescència els primers que utilitzo. O els nucleotis, hi ha diferents aproximacions. I al final de l' electroforessia el que tinc del capilar és un detector láser que irradia i conforme van passant els fragments

51:51

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Si aquest fragment està marcat, em donarà un pic de fluorescència que ho captarà. Per exemple, això es utilitza a la seqüenciació sangue, que és això que teniu aquí. Cada muntanyeta d'aquestes es diferencia un nucleòtic de l'altre. Però també s'interessa, es pot utilitzar, aprenent altres tècniques, per exemple, en proves de paternitat. Aquí ens passa de vegades que hi ha una mostra, que la traçabilitat de la mostra és dubtosa.

52:24

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Jo una vegada, en els gabinets de pròstata, teníem diversos pacients alhora, això cada vegada hi ha més mecanismes de seguretat del pacient perquè no pugui passar, però ens van portar sis putets amb sis pròstates i van dir, no sé quin pacient té de pròstatar. Tenim sis pacients, sis mostres, però jo m'he fet un embolic perquè teníem diversos pots alhora, sabent que alguns ens hem barrejat i no sabent qui és qui.

52:55

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

En aquests casos, per exemple, nosaltres el que fem és un semi-test de paternitat. No és un test de paternitat que miris molts marcadors, perquè només tenim sis persones candidates, però sí que mirem uns quants marcadors que són molt polimòrfics a la població. En el nostre cas, mirem seqüències de microsatèl·lits. Els microsatèl·lits, sabeu què són? Els que heu fet al seminari, no em recordeu?

53:27

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Els microsatel·lis són seqüències que són repetitives. A, A, A, A, A, A, C, T, C, T, C, T, C, T. Com són seqüències repetitives, a les nostres vegades la polimerasa, quan copia el genoma, s'equivoca i posa més o posa menys.

53:48

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Llavors, els fem servir per diverses coses. En el seminari de càncer colorectal ja van sortir, però molts d'ells, no tots, són polimòrfics a la població. Si estan en una zona que potser no és molt crítica, no té una funció, no tens un gen allà, doncs et trobes que una persona en té quatre A's i que una altra persona en té cinc i que una altra persona en té nou. I d'aquest, igual. Hi ha persones que tenen...

54:17

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

10 repeticions, hi ha persones que tenen 50 repeticions, i hi ha persones que tenen 40 repeticions. Jo sé que és polimòrfic, que és variable a la població.

54:32

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Què fem? Analitzem una sèrie de microsatèl·lics, que jo sé que ja són molt variables a la població, perquè hi ha altres que són estables, perquè estan en regions més crítiques. No, m'interessen aquells que estan en zones del genoma, que li és igual, pots tenir més o menys. I llavors, tu tindràs 4, jo tindràs 5 i el tindrà 8. Què és el que fem? Els amplifiquem amb marcadors que estan marcats en fluorescència. De manera que en aquest pacient...

55:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Jo simplifico això, poso un primer aquí, tindré 4, més els primers, una mida de, és igual, m'ho invento, de 100 per les bases. En aquesta persona tindré 101, i en aquesta persona tindré, si té 9, 105, no? Sí? Jo faig la letroforessi.

55:25

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I imaginem-vos, hi tinc mostres d'aquestes de sang d'aquests sis pacients, de sang o del reteixit, que jo sabia segur que és del pacient, i tinc les meves sis mostres, no sé què és d'aquí. Això és una de les mostres d'un dels pacients, i això són dos mostres problema. Només mirant això, això et separa per mires, d'acord? I tenim un pit principal, i després tenim altres petitets, perquè la polimerasa en el tub també s'equivoca, d'acord? Però tenim un principal.

55:55

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Només veient aquest patró. Això és molt intuitiu. Mostra A, mostra B. I pacient? Quina mostra és del pacient? Qui s'assembla més? Aquest, aquest o aquest, aquest? Aquest, aquest, no? Doncs ja sé que aquest pacient va amb aquesta mostra. He fet un test de paternitat. No mirem només un, mirem marcadors diferents. I mires que tot et quadri. És una de les aplicacions. I això a l'oestia es fa els tests de paternitat.

56:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Tot aquest rotllo era per dir que el seqüenciador capilar et separa molt finament per mides. Jo, si vull de 212 a 218 veure la diferència en un gel de grossa, no la veuré a no sé què siguin moda, mides molt diferents, necessito més resolució per veure aquests carnets més petits. Això passa cada vegada menys, però de vegades passa, perquè som humans i de vegades aquell dia estàs empanat i dius que he metido en cada tubo. I d'allà et va el diagnòstic.

57:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Vinga, altre tipus de PCRs que també es basa en sondes marcades en fluorescència és la PCR realtime. No confondre amb la RT-PCR de retrotranscripció. Hem vist abans retrotranscripció, és quan parteixo del RNA i l'he de convertir a l'NA.

57:29

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

La PCR a temps real és una PCR en la que ve sprimes o, en el nostre cas, amb més freqüència, sondes d'hibridació. Jo tinc uns sprimes que m'amplifiquen una determinada seqüència i unes sondes que dependen si en aquesta posició tinc una A, una T, una C o una G, m'hibriden en un color o un altre i em donen fluorescència, que és això en l'aparell de cap. I la capta cada sigla.

57:58

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Llavors, per exemple, si és un estudi de mutacions en carras, en aquest cas tenim aquesta corba que ens diu com és a cada cicle d'amplificació, al principi jo quasi no ho veig, a partir d'un moment d'un threshold comença l'amplificació exponencial del meu fragment i després, quan ja s'esgoten els reactius de la PCR, s'arriba en el cas de plató.

58:23

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Mentre que tens nucleòtics, va amplificant, quan ja s'acabaven els nucleòtics, això es queda igual. I anem més a una florescències. Aquest seria el control, que vol dir que tinc el gencarràs i que és amplificable. I després, jo tinc sondes que, o en vermell, o en groc, o en blau, o en verd, em detecten determinades mutacions amb una sonda d'ibridació que és específica. Aquí veig una que se'm dispara també, la control se'm amplifica,

58:54

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I aquí se'n dispara només aquesta, que és la vermella. Per tant, puc dir que tinc una mutació llet d'on s'ha fet. Les altres, perquè no les veig, estaríem per sota del nivell de detecció de la tècnica. Avantatges de la PCR a temps real? És molt sensible, perquè sí que és veritat que tinc competència pels primers, però com que tinc la sonda específica de la mutació, encara que jo tingui diluïdes les cèl·lules tumorals, sóc capaç de veure aquesta mutació, perquè li estic donant...

59:24

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

de sensibilitat que és posar aquesta sonda. Per tant, jo puc partir d'una mostra que tinc un 10% de tumor i jo veuré la mutació. En canvi, això que teniu a les vostres mans, que és una mutació, és un estudi sanguet, necessito un mínim, millor que tingui més, un 30% de tumor, perquè si no, no veuré. Desvantatge? 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8.

59:57

S… Speaker 2 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

puc veure aquestes 8 mutacions.

1:00:00

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

Si tinc una mutació diferent d'aquestes 8, és que no la veuré. Què passa? Que aquestes tècniques són més sensibles, acostumen a ser molt més ràpides, però si tu tens alguna cosa poc freqüent, pot ser que te la perdis. Estan dissenyades per veure les variants que són més freqüents, les que es troben amb més freqüència en els tumors. Si és un tumor que no pots estudiar d'una altra manera, benvingut sigui, perquè com a mínim podràs fer aquest estudi i descartar les coses que són més freqüents.

1:00:32

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

i això seria l'altre de la RT-PCR per exemple on s'aplica molt és per detectar gens de fusió tens el gen A i el gen B normalment les fusions gèniques es fan per tancaments que estan a nivell dels introns i els introns dels gens poden ser molt grans de quilobases o megabases i hem dit que els nostres femens són molt petits llavors

1:00:55

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

El que ens fem servir és que el que utilitzem és que quan jo tinc un gel de fusió, encara que això sigui variable, si jo agafo l'RNA i en aquest RNA missatger hem fet l'esplacing i l'hem eliminat els introns, aquí ja sí que tinc l'A i el B que estan molt a prop, jo puc dissenyar uns primers. Escripció, passa l'RNA al CDNA i aquí sí que tinc una mida que és amplificable. Múltiples ja l'han vist, això serien controls de qualitat.

1:01:30

S… Speaker 1 (PEM PHCA 5 - Parte Teórica)

I a base de la seqüenciació sànger, que serà l'exercici que farem, ens anem a fer una volteta per l'alaboratori, us l'ensenyo també perquè veieu com està organitzat i després ja fem la seqüenciació sànger i farem l'exercici. Deixeu-vos aquí i ja sabeu que la porta està...

PEM PHCA 5 - Parte Teórica

Resum

Pregunta a la IA sobre aquest entorn