biotechnologie c3

0:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Les double -brins se dérouvent,

0:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est ce qui est représenté ici,

0:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

pour finalement arriver à la catalyse et au

0:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

clivage des deux.

0:08

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc en fait,

0:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la manière dont cette nucléase fonctionne dans une cellule,

0:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

parce que ça c 'est une vitro,

0:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est dans un tube,

0:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est des protéines purifiées,

0:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

de l 'ADN purifié,

0:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais dans une cellule,

0:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ce qui se passe, c 'est que cette nucléase,

0:21

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle glisse sur l 'ADN.

0:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Tant qu 'il n 'y a pas de PAM,

0:24

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle glisse, elle glisse,

0:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle glisse, elle glisse.

0:26

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Dès qu 'elle rencontre une PAM,

0:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Elle s 'arrête un bref instant.

0:29

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Elle pose.

0:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Elle regarde si les 2 -3 nucléotides

0:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

à côté de la PAM sont complémentaires au guide.

0:37

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Si c 'est le cas,

0:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle reste un peu plus longtemps.

0:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Si la complémentarité est totale,

0:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle s 'arrête.

0:44

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Mais s 'il y a une de ces étapes,

0:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

si elle voit que la complémentarité n 'est pas parfaite,

0:51

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle va se décrocher.

0:52

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc elle scanne l 'ADN,

0:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle cherche une PAM.

0:56

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Dès qu 'elle trouve une pâme,

0:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle s 'arrête un petit peu.

0:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Elle regarde s 'il y a 2 -3 nucléotides à côté qui sont complémentaires,

1:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle s 'arrête un peu plus longtemps.

1:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Si tout est complémentaire,

1:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle s 'arrête et elle coupe.

1:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

C 'est comme ça que ça marche.

1:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc c 'est ce qui explique en partie le manque de spécificité de cette famille

1:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

de nucléases.

1:11

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

C 'est qu 'elle va stopper très souvent sur l 'ADN.

1:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et même si la complémentarité

1:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

n 'est pas parfaite,

1:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

à des moments,

1:21

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle va s 'arrêter suffisamment longtemps pour que les deux domaines nucléases cassent l 'ADN.

1:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Voilà, je voulais revenir là -dessus parce que je vous en avais parlé la dernière fois

1:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et j 'ai trouvé que cette diapo illustrait bien la façon dont fonctionnait Cas9

1:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et ça explique aussi partiellement

1:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

son manque de spécifiques.

1:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors,

1:46

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on va reprendre ce

1:51

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qui était

1:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

les limites de la

2:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

thérapie génique.

2:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors,

2:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

les limites technologiques de la thérapie

2:11

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

génique, ces limites sont de trois

2:15

S… Speaker 2 (biotechnologie c3)

types.

2:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Pourquoi faire la thérapie génique ?

2:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Thérapie génique au sens large,

2:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais ce dont on va parler là,

2:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est essentiellement l 'édition du génome,

2:24

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est -à -dire aller couper un génome complexe à un endroit bien précis pour faire une modification.

2:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ces limites,

2:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elles sont de trois types différents.

2:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il faut que la modification soit efficace.

2:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Pour couper l 'ADN,

2:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

si vous coupez un chromosome dans 1 % des cellules,

2:41

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous n 'allez pas aller loin.

2:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il faut que ce soit efficace.

2:45

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il faut que ce soit spécifique.

2:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous les coupez à un endroit et vous ne les pas couper à dix endroits dans le géant.

2:51

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et la troisième limite,

2:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est ce qu 'on appelle la vectorisation.

2:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

C 'est -à -dire comment,

2:56

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

quel vecteur vous allez utiliser pour envoyer votre modification

3:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

dans les cellules de l 'hôte.

3:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors on va voir qu 'il y a des vecteurs viraux.

3:04

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Les virus ont historiquement,

3:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

je vous l 'ai montré avec l 'histoire des bébés bulles,

3:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

historiquement les virus ont été utilisés.

3:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Mais on a développé d 'autres virus et surtout on a développé d 'autres vecteurs

3:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qui sont non viraux.

3:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

A l 'heure actuelle,

3:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Tous les labos du monde,

3:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

toutes les boîtes du monde se heurtent à ces trois limites

3:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qui sont l 'efficacité,

3:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la spécificité.

3:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors l 'efficacité,

3:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ce n 'est pas vraiment une limite en soi parce que les

3:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

CAS9 sont très efficaces,

3:33

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

les thaladones sont très efficaces,

3:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on a des nucléas qui sont très efficaces,

3:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qui coupent.

3:37

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc le problème de l 'efficacité n 'est pas vraiment un problème en soi.

3:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

La spécificité et la vectorisation sont les deux barrières à l 'heure actuelle.

3:44

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors on va d 'abord parler de spécificité.

3:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc je vous ai dit que Cas9 couche un petit peu partout.

3:50

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

C 'est dû entre autres à la façon dont elle

3:54

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

fonctionne, c 'est ce que j 'ai à vous montrer.

3:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc il y a des labos qui ont essayé de développer des

4:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

technologies pour mettre en évidence la présence de

4:04

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ce qu 'on appelle les sites off -target.

4:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc les sites on -target,

4:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

enfin le site on -target c 'est celui -là aussi,

4:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais les sites off -target c 'est ceux qui sont coupés,

4:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on ne voudrait pas que ce soit coupé.

4:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors comment on met ces sites en évidence ?

4:16

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

On utilise une approche génomique qui

4:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

consiste,

4:21

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc ça, ça a été développé dans la boulotifiante,

4:24

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais il y a d 'autres méthodes qui existent et qui sont similaires.

4:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc on a un noyau,

4:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

le noyau qu 'on cible avec une complexité génomique,

4:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

des dizaines de chromosomes,

4:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

voilà,

4:37

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et un site là -dedans,

4:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il y a un site qu 'on veut couper.

4:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Mais on sait qu 'il y en a d 'autres qui vont être coupés,

4:42

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc on veut les identifier.

4:44

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc on transfecte ces cellules de la classe 9 purifiée.

4:49

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et ce qu 'on appelle un ADN traceur,

4:51

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qui est représenté ici par ces petits bouts d 'ADN double bras orange.

4:54

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ce qui va se passer,

4:56

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est que CAS9 va aller couper son sit -on target.

5:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et il va peut -être aller en couper d 'autres.

5:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et c 'est cela qu 'on veut identifier grâce à cet ADN traceur.

5:04

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc quand on fait des cassures double grains dans des chromosomes,

5:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

en l 'occurrence c 'était du génome humain,

5:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais il faut faire ça avec notre génome préféré,

5:11

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

au site de cassure,

5:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous allez incorporer fréquemment des petits bouts d 'ADN.

5:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc si vous transfétez ces cellules avec de la nucléase et plein,

5:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

plein, plein, plein d 'ADN traceurs,

5:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

aussi que vous allez casser,

5:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous allez intégrer cet ADN traceur par ce qu 'on a vu la dernière

5:29

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

fois en combinaison de nomologues.

5:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Un bout d 'ADN qui traite dans le génome,

5:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

deux chromosomes qui se font,

5:33

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

un chromosome qui est coupé,

5:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ça répare et de temps en temps,

5:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

au site de réparation,

5:37

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il y a un petit bout d 'ADN qui va être incorporé.

5:39

S… Speaker 3 (biotechnologie c3)

Ça,

5:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est connu depuis très longtemps.

5:42

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc l 'intégration du traceur au site de coupure.

5:46

S… Speaker 4 (biotechnologie c3)

Après,

5:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous extrayez à l 'ADN,

5:49

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous voyez que votre ADN,

5:50

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il y a un des sites qui est le site que vous ciblez,

5:52

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et puis les autres sites qui sont des off -target,

5:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais il y a de l 'ADN orange à ces sites -là.

5:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous extrayez à l 'ADN,

5:59

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous le fragmentez,

6:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous l 'amplifiez par PCR en utilisant une amorce qui est spécifique,

6:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

une amorce orange,

6:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et puis des amorces aléatoires qui vont permettre d 'amplifier spécifiquement

6:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

les régions qui contiennent le traceur.

6:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et ça, vous mettez dans un séquenceur au débit,

6:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

type Illumina.

6:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et après,

6:16

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous mappez sur le génome,

6:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous cartographiez sur le génome tous les sites de Cassius.

6:20

S… Speaker 3 (biotechnologie c3)

D 'accord ?

6:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc ça,

6:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est une technique.

6:24

S… Speaker 5 (biotechnologie c3)

Désolé,

6:25

S… Speaker 2 (biotechnologie c3)

du coup,

6:26

S… Speaker 6 (biotechnologie c3)

là, ça va un peu vite.

6:27

S… Speaker 6 (biotechnologie c3)

Oui.

6:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il y a les thèmes qui sont un peu techniques,

6:29

S… Speaker 6 (biotechnologie c3)

je comprends pas.

6:30

S… Speaker 6 (biotechnologie c3)

Oui.

6:30

S… Speaker 4 (biotechnologie c3)

Alors,

6:31

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qu 'est -ce que vous n 'avez pas compris ?

6:33

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Je reprends tout depuis le début ?

6:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Oui, depuis le début.

6:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ok.

6:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc,

6:37

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous avez des cellules.

6:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Des cellules qui contiennent des chromosomes.

6:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ces chromosomes...

6:42

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous voulez couper un de ces chromosomes à un endroit particulier.

6:44

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Mais vous savez que votre nucléase,

6:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle va aller couper la tête.

6:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et vous voulez identifier ces sites.

6:50

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc ce que vous faites,

6:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est que vous transfectez votre cellule avec votre nucléase et un

6:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ADN.

6:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et cet ADN,

6:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

j 'ai des petits goûts d 'ADN,

7:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ça fait...

7:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

20, 25 nucléotides,

7:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

d 'accord, c 'est un tout petit bout d 'FDN.

7:04

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ils vont aller s 'intégrer,

7:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ils vont aller se positionner à tous les endroits où il y a des cassures.

7:08

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc vous avez une cassure là,

7:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais vous en avez,

7:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mettons, dix autres.

7:11

S… Speaker 2 (biotechnologie c3)

C 'est -à -dire,

7:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la nucléophyte,

7:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elle allait couper n 'importe où.

7:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Elle coupe n 'importe où.

7:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

La casse neuf, elle coupe.

7:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous étiez là pour dernier cours ?

7:19

S… Speaker 7 (biotechnologie c3)

Non, non.

7:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ah,

7:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

d 'accord.

7:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous venez d 'arriver là,

7:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est ça ?

7:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Oui. Ok,

7:24

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc si vous avez raté le cours précédent,

7:26

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

là, effectivement, il va falloir un peu rattraper,

7:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

parce que j 'ai parlé de tout ça la dernière fois,

7:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

en détaille.

7:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

les mécanismes de reconnaissance des nucléases.

7:34

S… Speaker 8 (biotechnologie c3)

Oui,

7:35

S… Speaker 2 (biotechnologie c3)

mais si on n 'a pas reçu le cours sur la plateforme.

7:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous n 'avez pas reçu le cours ?

7:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Le cours.

7:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Le cours,

7:42

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

comme j 'ai dit la dernière fois,

7:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

enfin la première fois,

7:44

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

le premier cours.

7:45

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ce soir,

7:46

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il sera sur Xquare.

7:47

S… Speaker 6 (biotechnologie c3)

D 'accord.

7:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Le PDF du cours,

7:49

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il sera sur Xquare ce soir.

7:50

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Mais je ne veux pas que vous l 'ayez avant le cours,

7:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

parce que sinon, vous allez le regarder sur votre rendez -vous de ne m 'écouter.

7:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Je le mets à la fin,

7:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

je fais ça pour tous mes cours.

7:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ce soir,

7:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il sera sur Xquare.

8:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous n 'avez pas besoin de juste écouter ce que je dis.

8:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Si vous avez des questions,

8:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous me les posez.

8:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ce soir,

8:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

le cours sera en entier sur WhatsApp.

8:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous pouvez prendre des photos,

8:11

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

médiapos, si vous voulez.

8:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ça, c 'est pas un problème.

8:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Je l 'ai dit au début,

8:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous pouvez prendre les diapos en photo.

8:16

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Tout ça, c 'est publié.

8:16

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il n 'y a rien de secret.

8:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Mais écoutez ce que je dis et posez des questions.

8:21

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc,

8:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ces types d 'ADN traceurs,

8:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ils vont aller se mettre un petit peu partout dans le génome.

8:31

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

On va récupérer cet ADN,

8:33

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on va extraire l 'ADN.

8:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

On va le séquencer,

8:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

peu importe la technologie,

8:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

peu importe.

8:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ce qu 'il faut retenir,

8:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est que c 'est une méthode qui permet d 'identifier tous les sites.

8:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc,

8:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

quand on fait ça,

8:49

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et qu 'on analyse ces sites,

8:52

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

que voit -on ?

8:54

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

On voit des choses très intéressantes.

8:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors, je vous ai mis ça,

8:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ce sont des séquenceurs éliminables.

9:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Je vous rappelle brièvement comment marche le séquençage éliminable.

9:04

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Enfin, normalement,

9:04

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous venez tous connaître ça.

9:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc les bouts d 'ADN que vous allez séquencer,

9:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est ce que vous allez séquencer,

9:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est les bouts d 'ADN qui contiennent le traceur orange.

9:16

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc là -dedans,

9:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il y a un bout d 'ADN orange,

9:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et puis de chaque côté,

9:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il y a de l 'ADN génomique.

9:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc Illumina,

9:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ça fonctionne avec ces espèces d 'adaptateurs un peu curieux en forme de Y.

9:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et

9:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc il y a deux manières de lire,

9:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

de lire une séquence,

9:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous pouvez lire dans ce sens -là,

9:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous pouvez lire dans ce sens -là.

9:41

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et le bout d 'ADN,

9:42

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il peut être inséré comme ça ou il peut être inséré comme ça.

9:44

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc en fait, le même bout d 'ADN,

9:46

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

d 'accord, peut être lu de quatre façons différentes.

9:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc la

9:52

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

façon dont on prépare une librairie

9:56

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

du Génard pour le séquençage,

9:59

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc on prépare la...

10:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

L 'ADN,

10:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc ça c 'est l 'ADN qui contient les petits bouts orange,

10:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

d 'accord,

10:04

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

dont je parlais juste avant.

10:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il y a ces fameux adapteurs,

10:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qu 'on colle aux extrémités,

10:11

S… Speaker 3 (biotechnologie c3)

d 'accord,

10:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc ils sont différents à gauche et à droite,

10:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est pour ça que là il y a du mauve,

10:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

là il y a du rose,

10:16

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ce ne sont pas les mêmes séquences.

10:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et le fait que ce ne soit pas les mêmes séquences,

10:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ça permet de savoir si on séquence à partir de là ou si on séquence à partir de là.

10:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc on les fixe sur ce qu 'on appelle une flossée,

10:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

en français.

10:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Je ne sais pas comment on dit,

10:31

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

enfin peu importe.

10:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Flowcell,

10:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est un tout petit machin grand comme ça,

10:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

qui va aller dans une de ces machines.

10:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors,

10:37

S… Speaker 6 (biotechnologie c3)

Illumina,

10:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ils ont différents systèmes de séquençage.

10:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Bon, là,

10:41

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

j 'ai mis que deux machines,

10:42

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais enfin, ils ont une gamme qui va des tout petits aux trucs qui permettent de

10:46

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

séquencer un génominal de jour.

10:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc,

10:49

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ces bouts d 'ADN,

10:51

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ils vont aller s 'attacher sur la Flowcell,

10:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

soit par le côté RAW,

10:56

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

soit par le côté mauve.

10:59

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et après, ce qui se passe,

11:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est que sur la flosselle,

11:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il y a des oligonucléotides,

11:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

des petits bouts d 'ADN qui sont complémentaires.

11:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Voilà,

11:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la partie mauve et la partie rose.

11:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc,

11:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ça va faire un pont,

11:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

comme ça.

11:11

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et après,

11:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on ajoute une polymérase qui va synthétiser l 'autre brin.

11:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Tout ça,

11:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est automatisé dans la machine,

11:21

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il n 'y a rien à faire.

11:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc,

11:24

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la synthèse du deuxième brin,

11:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et on se retrouve avec une molécule en forme de pont,

11:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

comme ça.

11:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc,

11:29

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous allez vous imaginer qu 'il y a plein de molécules en forme de pont.

11:31

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

un peu partout sur la flosselle.

11:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

On dénature l 'ADN,

11:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on se retrouve à nouveau avec du simple brun,

11:37

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on se retrouve exactement dans la même configuration que là,

11:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais juste qu 'il y a un peu plus de molécules sur la flosselle maintenant.

11:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et on refait des cycles.

11:45

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et ça, ça va former ce qu 'on appelle les clusters.

11:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors pourquoi on forme ces clusters ?

11:49

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

C 'est pour pouvoir détecter le signal.

11:50

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

En fait, toutes ces molécules simples brun là,

11:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elles sont toutes identiques entre elles.

11:54

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Elles ont toutes la même séquence puisqu 'elles viennent de la même molécule au départ qui s 'est déposée

11:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

sur la flosselle.

12:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et les clusters,

12:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est juste pour amplifier le signal.

12:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

S 'il y avait une seule molécule ADN,

12:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

le signal fluorescent,

12:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on ne le verrait pas.

12:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc on en fabrique 100,

12:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

500,

12:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

au même endroit,

12:11

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on forme un cluster pour amplifier le signal.

12:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc chacun de ces clusters contient des

12:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

molécules qui sont toutes identiques entre elles.

12:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

D 'accord ?

12:21

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ça permet juste d 'amplifier le signal.

12:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et puis après,

12:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

une fois qu 'on a formé des clusters,

12:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

On va synthétiser la première base.

12:29

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc on met un mélange de nucléotides A,

12:33

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

T, C, G qui sont tous marqués avec un fluorophore.

12:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc on va incorporer la première base.

12:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ça va envoyer un signal lumineux,

12:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

différent en fonction du nucléotide qui est incorporé.

12:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et chaque cluster va envoyer un signal.

12:46

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc là,

12:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

le premier cluster,

12:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

si c 'est un A,

12:50

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la première base va envoyer un signal rouge.

12:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Si c 'est un C,

12:54

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il va envoyer un signal bleu,

12:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

etc. Donc il y a un signal de couleur différent par cluster.

12:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et puis après,

12:59

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on synthétise la deuxième base,

13:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et puis la troisième base,

13:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

et puis ainsi de suite.

13:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et on fait des cycles multiples.

13:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc il y a une caméra qui regarde si ce cluster -là,

13:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il est rouge,

13:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vert, jaune,

13:11

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vert, jaune,

13:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

rouge, et donc il reconstitue la séquence.

13:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Ce cluster -là,

13:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il est vert,

13:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

bleu, bleu, jaune,

13:16

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

rouge, et donc il reconstitue la séquence,

13:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

etc. Donc chaque cluster donne naissance à une séquence.

13:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et si vous avez 100 000 clusters sur le Flowcell,

13:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous avez 100 000 séquences.

13:29

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et ces machines -là,

13:30

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

là, les grosses,

13:31

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

elles sont capables de lire des millions de clusters à la fois,

13:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc des millions de séquences à la fois.

13:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et donc à la fin,

13:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous avez toutes vos séquences qui font alors,

13:41

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est des séquences courtes Illumina,

13:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ça fait 150 à 200 paires de base,

13:45

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

enfin 150 à 200 de base.

13:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et si vous en avez 1 million,

13:51

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

1 million fois 100,

13:52

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous séquencez 100 millions de nucléotides en un

13:56

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

run. Mais en fait,

13:58

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

sur les grosses machines,

13:59

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il y a plus que la NexX 500.

14:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Sur les grosses machines,

14:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous séquencez maintenant,

14:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est de l 'ordre de 2,

14:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

3 ou peut -être même 4 génomiles à la fois,

14:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est -à -dire que vous avez des centaines de millions de clusters.

14:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

pour séquencer des milliards et des milliards de nucléotides en or.

14:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et puis après,

14:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous utilisez les méthodes de bioinformatique,

14:24

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

que vous allez voir bientôt en cours d 'ailleurs,

14:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

pour réassembler ces séquences et en refaire un genou.

14:29

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc ça,

14:31

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'était juste pour revenir sur cette méthode Illumina.

14:33

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous avez dû voir ça ou entendre parler de ça,

14:37

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

parce que c 'est la méthode de séquençage au débit la plus utilisée au monde depuis maintenant.

14:41

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Alors,

14:46

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc...

14:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Maintenant qu 'on s 'est un peu rafraîchi la mémoire

14:51

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

pour le séquençage,

14:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

comment on identifie nos sites off -target ?

15:01

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et puis au milieu,

15:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on a un bout d 'ADN qui contient ce petit traceur orange où on veut savoir

15:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

quelle est sa séquence.

15:08

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc on séquence

15:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

les signes.

15:15

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc je vous ai dit qu 'il y avait quatre moyens d 'avoir la séquence de ADN.

15:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Le bout d 'ADN peut être cloné comme ça ou

15:23

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

cloné comme ça.

15:25

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il peut être intégré comme ça ou intégré comme ça,

15:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

il peut être lu comme ça ou lu comme ça.

15:29

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc il y a quatre séquences possibles.

15:31

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Mais,

15:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

peu importe,

15:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

au final,

15:36

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est le même goût ADN.

15:38

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc là, dans cette étude -là,

15:39

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ils ont regardé 10 sites dans le génome différents.

15:42

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc les sites qui s 'appellent VEGFA1,

15:45

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

2, 3,

15:46

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

E, X1,

15:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est des noms de gènes.

15:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et HEK,

15:49

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est une lignée de cellules immortalisées.

15:52

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc dans les règles 293,

15:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ils ont regardé 4 sites différents.

15:56

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et ils ont regardé un peu des gènes partout dans le génome.

16:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc sur cette diapose qu 'il faut regarder,

16:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la petite barre rouge que j 'ai indiquée ici,

16:05

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est la PAM,

16:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

l 'endroit où se trouve la PAM.

16:07

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Vous voyez ici c 'est TGG,

16:09

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

là c 'est CGG,

16:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

là c 'est TGG,

16:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

donc c 'est NGG.

16:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc là vous avez la PAM et à gauche de la PAM,

16:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous avez le guide,

16:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

vous avez les 20 nucléotides du guide.

16:20

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc ils sont évidemment différents,

16:22

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

ce sont des guides différents à chaque fois puisqu 'on cible des sites différents.

16:27

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Et ici,

16:28

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la barre de couleur correspond aux différentes séquences qui ont été identifiées en fonction

16:32

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

si c 'est le bras plus,

16:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

le bras moins,

16:34

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

dans un sens ou dans l 'autre.

16:35

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc si on se concentre sur ce site en particulier,

16:40

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on voit que ces séquences -là,

16:43

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

je vous rappelle, ça correspond à l 'endroit où se trouve

16:47

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

le petit traceur orange,

16:48

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

c 'est -à -dire l 'endroit où ça a été coupé dans le gineau.

16:50

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Donc là,

16:53

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on voit qu 'à ce site -là,

16:55

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

la coupure a eu lieu 1,

16:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

2, 3,

16:57

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

4, 5 nucléotides avant la panne.

17:00

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Il y a un petit peu de coupure avant,

17:02

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

un petit peu de coupure après,

17:03

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

mais l 'essentiel de la coupure est 5 nucléotides avant la panne.

17:06

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

La plupart des séquences se trouvent 5 nucléotides avant la

17:10

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

panne. Pour le site 2,

17:12

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on voit 1, 2,

17:12

S… Speaker 4 (biotechnologie c3)

3, 4,

17:13

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

5, c 'est pareil.

17:14

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

L 'essentiel des coupures a eu lieu 5 nucléotides avant la panne.

17:17

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

Pour le site 3,

17:18

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

on voit que non, pas du tout.

17:19

S… Speaker 1 (biotechnologie c3)

En fait, l 'essentiel des coupures a eu lieu 3 nucléotides avant la panne.

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