5965195080011619698
Oct 22, 2026 09:01
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Despectus in Viam Permanentem →
Videtur solum
5:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ci soffermeremo sugli approcci
5:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che vengono utilizzati per le malattie
5:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
genetiche non considerando i
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
tumori,
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
perché la chiamata delle variate dei tumori è molto più complessa
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e quindi a meno per quest 'anno lasciamo la parte.
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
l 'esempio che utilizzeremo come idea di base
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per la chiamata di varianti nel contesto di malattie
5:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
genetiche causate da una...
5:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
da una variazione su un singolo gene o
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
su un numero abbastanza limitato di geni e basata sull 'uso
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
del concetto di trio,
5:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che probabilmente avete già visto in altri recorsi.
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S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
L 'ideale del trio è fondamentalmente padre e madre che non hanno
5:56
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la malattia e il figlio che hanno la malattia.
5:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il punto chiave è identificare che tipologia di
6:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
mutazione ha dato origine questo tipo
6:06
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di malattia.
6:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Le condizioni che possiamo avere,
6:09
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Speaker 1 (5965195080011619698)
come vedete,
6:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sono fondamentalmente tre.
6:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
O è un adenovo,
6:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi una mutazione che comparsa per la prima volta nel
6:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
figlio,
6:19
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
oppure siete in una situazione di malattia
6:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
autosomica recessiva perché siete in heterosigosi ed è soltanto
6:28
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
l 'homoticosi recessiva che permette di avere il fenotipo,
6:32
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi i due genitori sono in heterosigosi e non hanno il fenotipo.
6:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
si osserva.
6:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
L 'altra cosa è invece anche una malattia
6:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che sia collegata al cronosoma X.
6:45
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
6:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per parlare di questo tipo di
6:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
approcci dobbiamo fondamentalmente,
6:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
diciamo non rintrodurre perché dovreste aver sentito parlare durante
7:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la triennale,
7:01
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ma dovremmo almeno
7:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
rivisitare il concetto di tecnologie di sequenziamento di seconda
7:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
generazione che sono ormai da,
7:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
siamo quasi a 30 anni,
7:14
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sono uno standard consolidato.
7:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Le tecnologie di seconda generazione sono quelle che si basano
7:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sul concetto dell 'applicazione economica.
7:23
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi quello che è il passaggio dal metodo di Sanger che
7:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non era utilizzabile in un contesto
7:32
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
veramente massivo per il fatto che erano reagenti troppo costosi
7:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e il throughput,
7:37
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi la quantità di sequenze che potevano essere fatte in
7:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
contemporanea,
7:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
è troppo basso.
7:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Considerate che per i sequenziatori Sanger ce ne siano mai pochissimi
7:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
in circolazione,
7:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
un sequenziatore Sanger aveva 96 capilari.
7:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Una corsa da 800 minuti era più o meno 4 ore
7:56
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e quindi doveva continuare a vitalicare.
7:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
L 'approccio della seconda generazione ha cambiato questa visione perché ha
8:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
permesso di passare a un sequenziamento di sequenze più corte,
8:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
infatti il gergo del sequenziamento
8:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di seconda generazione,
8:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il nome in gergo è short read,
8:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi sequenze relativamente corte.
8:18
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Si chiamava short read perché quando sono nate erano proprio
8:23
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
corte, 25 -30 minuti.
8:25
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Adesso siamo arrivati a un compromesso che è
8:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
limitato fondamentalmente dalla tecnologia
8:33
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che viene utilizzata.
8:34
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
La limitazione odierna sono all 'incirca 150
8:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
minuti.
8:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi,
8:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quello che voi potete fare è sequenziare lo stesso pezzo di DNA
8:44
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dai vari lati 150 minuti.
8:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E il motivo,
8:49
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
lo vedremo tra un attimo,
8:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
perché è collegato proprio al modo con cui i cluster
8:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che devono essere utilizzati vengono generati.
9:01
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi, se considerate,
9:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questo è l 'articolo da cui è venuta fuori nata
9:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la tecnologia delle short reads e i leader,
9:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
diciamo,
9:14
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quasi incontrastati di questa tecnologia è Illumina
9:19
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e la piattaforma probabilmente usata nel 95
9:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
% o forse addirittura di più di tutti i sequenziamenti del mondo.
9:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
L 'idea di base è relativamente semplice.
9:33
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il problema
9:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di base è che il DNA nel sequenziamento
9:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di seconda generazione non può essere sequenziato in modo diretto
10:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi c 'è bisogno di un passaggio che è quello che viene chiamato amplificazione clonale.
10:05
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
L 'amplificazione clonale,
10:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
nel caso del sequenziamento di lumina,
10:09
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
si basa sulla possibilità di costruire
10:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questi raggruppamenti di sequenze che originano
10:18
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
da un solo perso di energia.
10:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Nelle versioni iniziali della tecnologia questo tipo di approccio
10:25
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
era collegato al fatto che voi avevate fondamentalmente
10:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
due diversi tipi di oli colucutivi
10:33
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
attaccati su una superficie di vetro e distribuiti
10:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
in modo completamente casuale.
10:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Fondamentalmente la quantità di sequenze
10:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di cluster che potevano essere generati dipendeva da quanto materiale veniva
10:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
caricato su questi vetri.
10:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Con una criticità,
10:57
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se voi caricavate troppo materiale rischiavate che
11:01
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
i vari cluster iniziassero a essere parzialmente sovrapposti e
11:05
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di conseguenza puntavate via completamente il sequenziamento.
11:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Diciamo che ci sono stati dei passaggi tecnologici che hanno migliorato
11:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questo tipo di approccio con la posizionamento casuale degli
11:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
uomini.
11:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che si usa adesso si usano quelle che vengono chiamate brussella
11:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
pattern.
11:28
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il pattern è dato da nanoponzetti perfettamente
11:32
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ordinati e il numero di questi nanoponzetti è fisso.
11:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
All 'interno di questi nanoponzetti esistono queste
11:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
coppie di oligo che sono posizionate.
11:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi il concetto di base è che all 'interno di un altro prozzetto
11:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
entra una sua polizuola di DNA,
11:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
c 'è una procedura di liquidazione così veloce
11:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che tecnicamente è estremamente
11:57
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
raro l 'ingresso di due sequenze di DNA.
11:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E voi avete miliardi di questi prozetti a
12:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
parte su queste prozette.
12:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
L 'evoluzione in questo tipo di ambito è stata prevalentemente collegata
12:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
al fatto che il numero di microbozzetti
12:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
è progressivamente aumentato e questo di conseguenza ha aumentato
12:22
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
le possibilità di generare sequenze e ha abbassato il costo
12:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
medio di conseguenza.
12:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Se considerate il sequenziamento del genoma umano come medio
12:31
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di Sanger è venuto a costare
12:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
qualcosa di 200 milioni di dollari a quel tempo.
12:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Oggi,
12:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se volete sequenziare il vostro DNA,
12:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
lo potete mandare sui vari siti che fanno sequenziamento e
12:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
avete un sequenziamento 30x per almeno di 800 euro.
12:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Poi parleremo del concetto di 30x per così.
12:53
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
12:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
fondamentalmente quello che vedete qua è la situazione in cui
12:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il singolo prezzo DNA è entrato all
13:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
'interno di uno di questi
13:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
nanopossetti.
13:09
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E se vedete,
13:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questo pezzo di DNA in realtà è la prima
13:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
parte della formazione dell 'applicazione
13:20
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
climata, perché se vedete è legato covalentemente alla
13:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
superficie solida.
13:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Questo perché il complementare si è attaccato all 'oligo verde
13:31
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e poi è stata fatta una collegializzazione in modo da partire all 'oligo verde
13:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e avere la prima coppia del vostro pezzo di DNA.
13:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Poi denaturate e questa cosa si sta.
13:41
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
13:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
una cosa importante negli approcci di applicazione clonale sviluppati
13:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
da Illumina è che voi non usate la temperatura per le fasi
13:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di annealing e denaturazione.
13:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Questo che vuol dire?
13:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Vuol dire che usate condizioni di solvente che
13:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
favorescono la rottura dei legami idrogeno del DNA,
14:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi separano le eliche,
14:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
o favorescono la loro ventilazione.
14:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi c 'è un costante flusso di cambiamento di sorventi che
14:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
determina questo tipo di eventi.
14:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Nella fase cronale che cosa dobbiamo fare?
14:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Abbiamo bisogno di aumentare il numero di copie di questo singolo
14:20
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
elemento.
14:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E questo può essere fatto,
14:23
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se voi considerate il fatto che se avete una sola molecola,
14:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la molecola DNA è molto flessibile,
14:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi...
14:31
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se avrà tutta la possibilità di muoversi all 'interno del pozzetto
14:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e d 'identificare con l 'altro oligo la sua sequenza
14:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
complementare.
14:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi forma quello che viene semplicemente un ponte.
14:44
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
A questo punto,
14:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dopo questa condizione di primo ciclo di alibi,
14:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
voi cambiate un po' solamente,
14:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
inserite una polimerasi e sintetizzate il
14:57
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
filamento complementare.
15:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
punto che cosa succede?
15:01
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Cambiate di consulmento in modo che favorisca la denaturazione
15:05
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che avete due pochi.
15:06
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E di qua la cosa diventa esponenziale.
15:09
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Non dovete far altro che ripetere questo ciclo,
15:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
un numero fisso di volte in generale sono 35 cicli,
15:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per avere abbastanza sequenze.
15:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
abbastanza sequenze per costruire questi elementi che sono i cluster.
15:28
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che vedete qua è una figura un po' vecchia per cui questi cluster
15:32
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sono collegati alle cellule,
15:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
scusate,
15:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ai metrosselli non ancora abbattano,
15:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per cui erano cluster disponibili.
15:41
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Però il concetto è ovviamente lo stesso,
15:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ognuno di queste zone che vedete indicate con un
15:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
colore più chiaro formamentalmente indicazioni dove c 'è abbastanza DNA
15:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per poter identificare la reazione.
15:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
15:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se voi guardate questo sistema qua,
15:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questo ciclo,
15:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
siamo così come nelle
16:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
condizioni di poter sequenziare la
16:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
nostra molecola di DNA che era questa?
16:14
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
C 'è un problema in questo approccio al momento.
16:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Riusciamo ad adjudicare,
16:18
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ma c 'è un problema che dovreste riuscire a valutare.
16:22
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Perché se
16:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
io mi fermassi qua,
16:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non potrei ottenere una sequenza chiara del mio pezzo di DNA.
16:31
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quanti tipi di
16:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
molecole avete qua,
16:37
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
alla fine dei 35 cicli?
16:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Tipi,
16:41
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
un tipo o due tipi?
16:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
La reazione?
16:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi quello che succede è che nel momento in cui vado a sequenziare,
16:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la sequenza diventa forward e traverso.
16:57
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi deve esserci un sistema per risolvere questo.
17:01
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che è stato fatto è che quello che vedete qua è indicato come di oro,
17:05
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
è fondamentalmente una molecola che ha un legame
17:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di solturo.
17:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi che cosa succede?
17:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Alla fine del processo di amplificazione dei 35 cicli,
17:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quello che viene matto viene passato il solvente fortemente riducente
17:20
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e quello che succede è che il diodo viene ridotto
17:25
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e la molecola,
17:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
una delle due molecole,
17:28
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
viene mandata lì.
17:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi di conseguenza vi ritroverete soltanto un tipo di molecole
17:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
all 'interno del sistema.
17:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Immaginatevi quindi che siete in questa situazione qua,
17:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
però il tipo di molecole è soltanto che considerate un forward da semplicità.
17:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Che cosa succede?
17:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che abbiamo detto anche in precedenza
17:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
è che il sequenziamento...
17:57
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non lo facciamo,
17:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
specialmente sul DNA,
17:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dove siamo interessati ad avere copertura,
18:01
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi vogliamo leggere le più sequenze possibili.
18:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ogni singolo frammento non lo leggiamo solo da una parte,
18:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
perché i frammenti sono lunghi su più o meno 500 minuti,
18:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi dobbiamo leggere anche dall 'altra per avere incremento
18:14
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di copertura.
18:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Perché nel sequenzamento del DNA quello che è importante
18:19
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non è riconoscere il singolo elemento,
18:23
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
come nella trascrizione dove volete riconoscere.
18:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il trascritto,
18:28
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il gene,
18:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
volete riconoscere un elemento quantitativo e di conseguenza basta
18:33
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quantificare quante volte un pezzo che appartiene a quel gene
18:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
viene trovato.
18:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Qui volete sequenziare la maggior parte del genoma o delle zone
18:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che vi sono a disposizione.
18:44
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi, dato che io sto chiamando varianti,
18:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
è senso far sequenziare un pezzo di DNA solo da un lato e lasciare l 'altro pezzo
18:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
completamente sconosciuto.
18:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Sequenzia anche da un 'altra parte.
18:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
La domanda è,
18:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
però, una volta che ho costruito il mio cluster,
18:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
come faccio a pensare che ho
19:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sequenziato l 'elica forma?
19:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Come posso andare dall 'altra parte e sequenziare l 'elica reversa?
19:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Si basa sullo stesso concetto dell 'uso del diodo.
19:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che succede,
19:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dato che voi vi ritroverete tanti filamenti singoli,
19:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
tutti con lo stesso orientamento,
19:19
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ma il complementare...
19:22
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
continua a essere presente.
19:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Non quello del biolo,
19:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ma fondamentalmente immaginatevi la situazione in cui il
19:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
verde continua a essere presente.
19:31
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
No,
19:33
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
li abbiamo attaccati così e quindi il biolo è stato tagliato.
19:37
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che poi vi ritrovate,
19:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
vi ritrovate un pezzetto di DNA che può essere ancora utilizzato per
19:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ibridare la parte libera del vostro pezzo
19:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di DNA.
19:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi che cosa fate?
19:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Prendete tutto il cluster,
19:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
gli fate fare tanti glitch con l
19:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
'elica complementare e costruite di nuovo la condizione che avete
19:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
qui.
20:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
però non volete fare i principi,
20:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ne fate solo uno,
20:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
perché io ho il mio cluster,
20:06
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non faccio niente altro che di nuovo rimettarmi nella condizione che ho in questo
20:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
punto. Ci siete con l 'idea?
20:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Faccio l 'idea.
20:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
20:20
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il mio problema qual è?
20:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Io ho questo pezzo di DNA e io
20:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
lo voglio sequenziare sia da questa parte che da questa parte qua.
20:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
20:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quando costruisco il cluster,
20:32
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
immaginiamo di avere i triangoli e i quadrati,
20:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Io in questo momento ho tagliato qui dove c 'era
20:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il diolo sui quadrati e ho fondamentalmente un pezzo di DNA
20:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che ha questo orientamento qua.
20:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ok?
20:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Lo faccio solo con due perché è solo più facile.
20:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ci siete come idea?
20:56
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Qua c 'era l 'altro complementare,
20:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ho usato il diolo e l 'ho tagliato,
20:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
però l 'oligo è ancora qua.
21:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Io ho tagliato soltanto il pezzettino che mi staccasse il
21:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
complementare.
21:05
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ci siamo come idea?
21:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Adesso che cosa faccio?
21:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Dato che però questo è complementare a questo,
21:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
io posso creare il mio ponte.
21:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E quindi mi ritroverò
21:20
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
nella situazione di avere di nuovo esattamente la
21:25
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
stessa situazione che vedete lì,
21:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dove ci siamo
21:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
come idea.
21:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
A questo punto li posso raddrizzare e mi ritrovo di nuovo
21:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
nella mia situazione di partenza,
21:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dove avrò
21:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
qui quello con il quadrato.
21:49
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Qui il triangolino,
21:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
qui il quadrato e qui
21:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il triangolo.
21:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora,
21:57
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questi qua avevano il diolo prima e sono finiti.
22:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ormai sono fissi,
22:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non li posso più buttare via.
22:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Qui c 'è un altro reagente che ha un 'altra chimica,
22:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che non è una chimica basata sulla riduzione.
22:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Facendo un trattamento di taglio di questo
22:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
residuo modificato,
22:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
io quello che posso eliminare sono queste parti.
22:20
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E così mi trovo,
22:22
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il cluster è già dato dalle centinaia di migliaia
22:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di sequenze che ho generato con i 35 cicli di amplificazione,
22:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ma l 'ho semplicemente rigirato al contrario e quindi lo potrò sequenziare
22:34
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dalla parte forza.
22:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Perché se avevo il quadrato
22:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sequenziavo dal quadrato e adesso avendo un rigirato sequenzio
22:44
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dal triangolo.
22:45
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ci siete come idea?
22:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi, fondamentalmente,
22:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
una volta che avete fatto il vostro cluster,
22:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
siete nelle condizioni da poter,
22:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
senza nessun problema,
22:53
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sequenziare o un lato o un lato.
22:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi,
22:56
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il vantaggio dell 'amplificazione clonale viene fatto una volta,
23:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
una volta che avete il cluster lo potete reggirare.
23:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ora,
23:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questo è un video che vi fa vedere come funziona il sistema.
23:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
È già basato sulle cellule a pattern,
23:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sulle flossella pattern.
23:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi, quello che vedete qua sono i vari consetti.
23:19
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e quello che vedete all 'interno dei pozzetti qua abbiamo
23:23
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
oligo che sono diciamo blu e porcola
23:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e entra la singola
23:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
molecole delica.
23:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Se vedete l 'elica è entrata,
23:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questo è un pochino veloce per farvi il taglio e adesso
23:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
parte la polimeritazione e faccio la mia cosa.
24:05
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
momento che cosa succede?
24:06
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Cambio,
24:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questo qua è stato un cambio di risolvente che sta rimuovendo
24:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la liquidazione e cominciano a
24:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
crearsi molti.
24:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora
24:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se vedete per il momento abbiamo ancora le due tipologie
24:28
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di molecole,
24:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quelle basate sul primer 2
24:34
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e sul primer popola.
24:36
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quando abbiamo raggiunto il numero massimo di
24:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
cicli
24:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Vedete che uno viene tagliato ma l 'oligo rimane.
24:46
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi ogni oligo,
24:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per fare l 'utilizzazione con quello che si trova dall 'altra parte,
24:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
mi servirà dopo che ho sequenziato un lato
24:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dei miei 150 ducatili,
24:56
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
poi potrò cominciare a sequenziare.
25:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Allora, la domanda è,
25:01
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
perché 150 ributini?
25:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Per quanto i sistemi enzimatici
25:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
siano estremamente efficienti,
25:09
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non hanno mai un 'efficienza del 100 % sempre.
25:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Per cui, man mano scantata avanti nella reazione,
25:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
rischiate di fare degli attori.
25:18
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e 150 rubri di tivi rappresentano il compromesso per
25:22
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
avere una sequenza di alta qualità quindi che nelle parti iniziali
25:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e nelle parti finali contenga un numero omogeneo
25:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
potenziale di errori che possono avvenire ma che non aumentano
25:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
mano a mano che la sequenza si alloggia.
25:37
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il motivo per cui non si sequenza oggi 150 rubri di tivi è
25:41
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
perché si potrebbe fare.
25:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Però in contesti di questo genere verrebbero inserite mutazioni che
25:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
alla fine non ci farebbero usare la quantità di informazioni che
25:51
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
abbiamo acquisito in più,
25:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per cui sarebbero utili.
25:53
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ok,
25:56
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
adesso una volta che abbiamo preparato il nostro blocco clonale,
26:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi quello che deve essere applicato,
26:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
c 'è anche un altro punto da considerare.
26:05
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
C 'è un limite nella dimensione dei frammenti che possiamo
26:09
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sequenziare,
26:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
anche utilizzando le cellular pattern.
26:14
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il limite è 500 .3.
26:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Qual è il motivo?
26:18
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Uno perché 500 .3 in ogni caso riescono
26:22
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
a fare dei ponti all 'interno del singolo
26:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
pattern, quindi questo è essenziale.
26:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il problema qual è?
26:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Se voi avete oligo più lunghi,
26:34
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questi potrebbero fare un ponte,
26:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ad esempio su un altro pattern potenzialmente
26:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
vicino.
26:43
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Gli eventi sono molto rari,
26:45
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
per cui tendenzialmente in questo tipo di amplificazioni cronali
26:49
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non riuscite a avere...
26:52
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
diciamo gli eventi più grossi,
26:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
semplicemente perché non c 'è la possibilità di fare un ponte da un 'altra parte e
26:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
i frammenti massimi sono 500.
26:59
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quando si usavano i sistemi non a
27:10
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
pattern, che cosa succedeva?
27:12
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il numero di cicli compressivi è sempre lo stesso.
27:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Però, che cosa succede?
27:18
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
La superficie,
27:19
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se voi aumentate la lunghezza del frammento che deve fare
27:23
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il bridge,
27:25
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la superficie si allargherà,
27:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ma la quantità di sequenze è sempre la stessa,
27:31
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quindi vi ritrovereste ad avere la stessa intensità ma distribuita
27:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sulla superficie più ampia.
27:37
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi vuol dire che l 'intensità si abbassa.
27:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il risultato è che,
27:41
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
oltre al fatto che è più facile avere cluster che si sovrappongono,
27:45
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quello che succede è che l 'intensità è più bassa,
27:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
viene lenta come rumore e ovviamente è vero.
27:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Per cui il limite fisico dei 500 microditi è
27:54
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
collegato alla quantità di sequenze che voi avete in
27:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
uno spazio sufficientemente piccolo da avere un segnale aggregato
28:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che può essere visualizzato e che è la condizione
28:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
che è stata ottimizzata nelle cellule a patte.
28:14
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi qua siamo arrivati nello step dopo.
28:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Abbiamo costruito tante copie dello stesso tipo all 'interno
28:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di ogni bozzetto e quindi che cosa facciamo?
28:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Andiamo a fare un sequenziamento dove attacchiamo
28:30
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dall 'altra parte il prior control.
28:33
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
e il brano del corpo a questo punto è il punto di attacco per la valenza.
28:37
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che viene fornito a questo punto è la polimerasi e tutti
28:41
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
i quattro le polimerasi.
28:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
I noclitidi sono marcati sul tre primo con un clorofolo
28:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di colore diverso.
28:48
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Che cosa succederà?
28:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Voi riuscite a fare...
28:56
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi quello che voi riuscite a fare,
28:58
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
il 5' del vostro nucleo di delivero,
29:03
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
si legherà al 3' del primer,
29:06
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
perché il 3' del primer è disponibile.
29:09
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Una volta legato,
29:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la reazione non va più avanti perché il vostro 3' è bloccato
29:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
al suo corpo.
29:16
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi questa è la reazione che funziona una singola base
29:20
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
alla volta.
29:21
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Se vedete l 'esempio,
29:24
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
se non entro alla base giusta,
29:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
non succede niente.
29:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Se entro alla base giusta,
29:29
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
questa è la condizione in cui voi bloccate il
29:33
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
sistema.
29:34
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi,
29:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
alla fine di questo primo ciclo di,
29:38
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
diciamo,
29:39
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
addizione del prototide,
29:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
come si fa?
29:41
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Si lava via tutto quello che non si è legato e a questo punto c 'è
29:45
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
uno scanner con una luce che permetta
29:50
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
la visione della fluorescenza del vostro segnale,
29:53
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
poi avete questo scanner attraversa tutta la Frosel e rivela
29:57
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
i vari colori per ogni atto.
30:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi qua è il gioco,
30:02
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
motivo per cui riusciamo a sequenziare anche nelle
30:06
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
macchine moderne,
30:07
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
riuscite a sequenziare in teoria qualcosa come un genoma
30:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ogni 4 -5 ore.
30:13
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Il punto chiave è il fatto che voi state sequenziando tantissime sequenze
30:17
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
contemporaneamente.
30:18
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quindi siete andati al di là della problematica
30:22
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
di Sanger.
30:23
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Sanger sequenzava più lungo,
30:25
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
ma ne sequenziava molto poco,
30:26
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
una quanta sera alla volta.
30:27
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Qui siete nell 'ordine di miliardi di sequenze che vengono fatte contemporaneamente.
30:32
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Quello che succede quindi a ogni ciclo,
30:35
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
voi avete l 'addizione di chiaramente che cosa succede.
30:40
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Una volta rivelato il segnale,
30:42
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
quello che succede è che si fa un passaggio a un reagente chimico che taglia
30:47
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
dal treprimo via il cronforo,
30:49
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
si lavora tutto e avete semplicemente un primer esteso che
30:53
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
rappresenta il punto di partenza per andare avanti.
30:55
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
E con questo sistema voi
31:00
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
alla fine riuscite a leggere un passo alla
31:04
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
volta, tutto quello che sta succedendo nei vostri
31:08
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
miliardi di minuti.
31:11
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Cosa succede quando dovete passare dall 'altra parte?
31:14
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
Ricordatevi,
31:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
tagliate,
31:15
S…
Speaker 1 (5965195080011619698)
in questo caso con l 'altro reagente che non è un diolo,
Haec transcriptio a AI (recognitione automatica loci) generata est. Errores continere potest - contra audio originalem verificare ut criticum utentur. Politicae
Summa
Haec pagina de scriptura explicat, quae ad scripturam translativam pertinet.
Summa...
De hoc translatio scripsit.
Quod ad hoc adscriptum est, quod ad hoc adscriptum est, et adscriptum est.